Mitochondriale Ca^{2 +} Retention Kapazität Assay und Ca^{2 +}-mitochondriale Schwellung Assay ausgelöst

Mitochondrien sind die zellulären Hauptorgane, fast 95 % der verwendeten in den Säugetier-Zellen durch Oxidative Phosphorylierung ATP zu produzieren. Es wird berichtet, dass die abgesonderten mikromolaren Konzentration von Ca^{2 +} von Mitochondrien, die Anwesenheit von ADP und anorganischem Phosphat ADP zu ATP-Synthese¹phosphorylieren verwendet werden können. Wenn die Konzentration der cytosolischen Ca^{2 +} einen Schwellenwert überschreitet, Mitochondrien können Aufnahme Ca^{2 +} schnell und Ausfluss es langsam. So können die funktionierenden Mitochondrien Zustrom der erhöhten cytosolischen Ca^{2 +}. Irrelevant für die Teilnahme an der Oxidative Phosphorylierung, die mitochondriale Ca^{2 +} auch an der cytosolischen kalziumsignale teilnehmen und aktivieren den mitochondrialen Apoptose-Mechanismus durch Induktion die Eröffnung der mPTP in der inneren mitochondrialen Membran-². Es wurde allgemein anerkannt, dass abnorme Erhöhung der intrazellulären Ca^{2 +} mitochondriale massive Schwellung hervorrufen kann, durch die Eröffnung der mPTP-³. So, dieses Protokoll zielt darauf ab, die Funktion der Mitochondrien zu bewerten, indem Sie die Quantifizierung der mitochondrialen Ca^{2 +} Rückhaltevermögen und Ca^{2 +}-trigged mitochondriale Schwellung.

Ca^{2 +} Rückhaltevermögen ist das Maß für die Fähigkeit der Mitochondrien zur Aufnahme zytosolischen Kalzium. Mitochondrien können Puffer freie zytosolischen Kalzium und Kalzium-abhängigen zellulären Prozesse zu regulieren, indem Calciumaufnahme in Form von inaktiven Ausscheidungen. Beeinträchtigt Ca^{2 +} Rückhaltevermögen tritt in Stress-Erscheinungen, die mit Energie-Begrenzung und auch Neurodegenerative Krankheiten^4,5. Isolierte Mitochondrien oder Digitonin-permeabilized Zellen eingesetzt werden, um die Ca^{2 +} Rückhaltevermögen zu identifizieren, und die erhöhte Fähigkeit zu akkumulieren Ca^{2 +} durch isolierte Mitochondrien mit dem Additonal Glutamat und Malat erfolgt nicht durch die Mitochondriale Isolierung Verfahren⁶. Eine betitelten Menge an Digitonin sollte verwendet werden, um die Plasmamembranen von verschiedenen Zelltypen permeabilize. Das Hexapotassium Salz der Ca^{2 +}-Bindung grünen fluoreszierenden Farbstoff, Ca^{2 +}-sensible Zelle-impermeant Licht-erregbare Sichtanzeige, wurde weit verbreiteten⁷. Ca^{2 +}-Bindung grün fluoreszierenden Farbstoff ist ein Low-Affinität-Indikator und verwendet, um anzuzeigen, dass intrazelluläre freie Ca^{2 +} Konzentrationen im steigen weiter (5 min) Stimulationen⁸verlängert. Diese Methode war weniger empfindlich als die radioaktive Filtertechnik aber wesentlich vereinfacht. Das zusätzliche Ca^{2 +} Kalzium grüne Fluoreszenz erhebt und die Ca^{2 +} Aufnahme von Mitochondrien kehrt die Fluoreszenz Baseline. Fortlaufende Ergänzungen von Ca^{2 +} wurden vorgenommen, bis die Mitochondrien zur Aufnahme Extramitochondrial Ca^{2 + 9}nicht. Ein Fluoreszenz Mikrotestplatte Leser lässt sich regelmäßig Kalzium grüne Fluoreszenz Berichten.

Nach Ca^{2 +} Akkumulation Mitochondrien depolarisiert, Ca^{2 +} in das Medium abgegeben und begann anzuschwellen. Ca^{2 +}-Mitochondrien Schwellung verwendet wird, um die mPTP Öffnung zeigen ausgelöst. Elektronenmikroskopie und die Abnahme der leichten Extinktion bei 540 nm kann verwendet werden, um die Ca^{2 +}Messen-mitochondriale Schwellung^10,11ausgelöst. Mitochondrien Volumen kann direkt durch nach vorne Winkel Lichtstreuung¹², ermittelt werden, wo sinkt in die Extinktion passive Schwellung der mitochondrialen Matrix widerspiegeln.

Hier zeigen wir die Methodik zur Prüfung der mitochondrialen Ca^{2 +} Rückhaltevermögen und Ca^{2 +}-mitochondriale Schwellung in isolierten Mitochondrien aus SH-SY5Y Zellen ausgelöst.