Ca מיטוכונדריאלי^{2 +} שמירה קיבולת Assay ו- Ca^{2 +}-עוררה Assay נפיחות מיטוכונדריאלי

המיטוכונדריה הם האיברים הסלולר העיקרי לייצר כמעט 95% מ- ATP המשמש בתאים בתרבית של זרחון חמצוני. הוא דיווח כי הריכוז micromolar מוחרמת של Ca^{2 +} על ידי המיטוכונדריה, הנוכחות של ADP, פוספט אורגניים ניתן להשתמש כדי phosphorylate ADP סינתזת ATP¹. כאשר הריכוז של Ca cytosolic^{2 +} עובר מעל לסף מסוים, המיטוכונדריה יכול ספיגת Ca^{2 +} במהירות, בזרימת אותו לאט לאט. לפיכך, המיטוכונדריה מתפקדת יכול זרם מוגברת cytosolic Ca^{2 +}. לא רלוונטי-ההשתתפות זרחון חמצוני, מיטוכונדריאלי Ca^{2 +} גם לקחת חלק אותות cytosolic סידן ו להפעיל את מנגנון מיטוכונדריאלי אפופטוטיים להיפגע על ידי גרימת הפתח של mPTP הפנימי מיטוכונדריאלי ממברנה². זה הוכרה נרחב חריג על ידי העלאת Ca תאיים^{2 +} יכול לגרום נפיחות מסיבית מיטוכונדריאלי על-ידי פתיחת mPTP³. לפיכך, פרוטוקול זה נועד להעריך את הפונקציה מיטוכונדריאלי מאת לכימות על Ca מיטוכונדריאלי^{2 +} שמירה קיבולת ו Ca^{2 +}-trigged מיטוכונדריאלי נפיחות.

Ca^{2 +} שמירה התפוסה היא מידת היכולת של המיטוכונדריה ספיגת הסידן cytosolic. המיטוכונדריה ניתן מאגר הסידן חינם cytosolic, לווסת סידן תלוית תהליכים תאיים על ידי ספיגת הסידן בצורה של פוחת משקעים לא פעיל. Ca לקוי^{2 +} שמירה קיבולת מתרחשת מתח תופעות הקשורות באנרגיה הגבלה,^4,של מחלות ניווניות אפילו⁵. המיטוכונדריה מבודד או תאים digitonin permeabilized יכול לשמש כדי לזהות את Ca^{2 +} השמירה קיבולת, ואת היכולת מוגברות לצבור Ca^{2 +} על ידי המיטוכונדריה מבודד עם נוספים גלוטמט, בנויים לא מושפע על ידי בידוד מיטוכונדריאלי נוהל⁶. כמות titrated של digitonin צריך לשמש permeabilize של ממברנות פלזמה של סוגי תאים שונים. Hexapotassium מלח Ca^{2 +}-איגוד ירוק הפלורסנט, Ca^{2 +}-אינדיקטור רגיש תא-impermeant אור-טמפרמנט גלוי, היה בשימוש נרחב⁷. Ca^{2 +}-איגוד ירוק הפלורסנט מחוון נמוך-זיקה ולא להשתמש בו כדי להראות כי תאיים חינם Ca^{2 +} ריכוזים ימשיכו לעלות במהלך ממושך (5 דקות) stimulations⁸. שיטה זו היה פחות רגיש יותר הטכניקה מסנן רדיואקטיבי, אולם היה לפשוט מאוד. נוספים Ca^{2 +} מעלה סידן ירוק פלורסצנטיות, Ca^{2 +} תפיסה על ידי המיטוכונדריה ומחזירה את קרינה פלואורסצנטית בסיסית. תוספות רציפים של Ca^{2 +} נעשו עד המיטוכונדריה נכשלה ספיגת extramitochondrial Ca^{2 + 9}. קורא microplate קרינה פלואורסצנטית ניתן לדווח באופן רציף על ידי קרינה פלואורסצנטית סידן ירוק.

לאחר צבירת^{2 +} Ca, המיטוכונדריה depolarized שוחרר Ca^{2 +} לתוך המדיום, החלה להתנפח. Ca^{2 +}-עוררה המיטוכונדריה נפיחות משמש לציון פתיחת mPTP. מיקרוסקופ אלקטרוני ו של הפחתת ספיגת האור-540 nm יכול לשמש כדי למדוד את Ca^{2 +}-עוררה מיטוכונדריאלי נפיחות^10,11. המיטוכונדריה נפח יכול להיקבע באופן ישיר על ידי קדימה זווית פיזור אור¹², איפה ירידות ספיגת לשקף פסיבית נפיחות של המטריקס מיטוכונדריאלי.

כאן, אנחנו להמחיש את המתודולוגיה לבחון על Ca מיטוכונדריאלי^{2 +} שמירה קיבולת ו^{2 +}Ca-עוררה נפיחות מיטוכונדריאלי בתוך המיטוכונדריה מבודד מתאי SH-SY5Y.