Mitochondrial Ca^{2 +} rétention capacité dosage et Ca^{2 +}-déclenchée gonflement Mitochondrial test

Les mitochondries sont les principaux organes cellulaires pour produire près de 95 % de l’ATP utilisé dans les cellules de mammifère par la phosphorylation oxydative. Il est signalé que la concentration micromolaire séquestrée de Ca^{2 +} par les mitochondries, la présence d’ADP et de phosphate inorganique peut être utilisé pour phosphoryler l’ADP à la synthèse d’ATP¹. Quand la concentration cytosolique Ca^{2 +} va au-delà d’un seuil, les mitochondries peuvent absorption Ca^{2 +} rapidement et l’efflux il lentement. Ainsi, les mitochondries de fonctionnement peuvent afflux l’augmentation Ca cytosolique^{2 +}. Sans rapport avec la participation de la phosphorylation oxydative, la mitochondrial Ca^{2 +} également prendre part à des signaux de calcium cytosolique et activer le mécanisme apoptotique mitochondriale en provoquant l’ouverture de la PFMP en interne mitochondriale membrane². Il a été largement reconnu qu’élévation anormale de la Ca intracellulaire^{2 +} peut induire mitochondrial enflure massive en ouvrant le mPTP³. Ainsi, le présent protocole a pour but d’évaluer la fonction mitochondriale en quantifiant la capacité mitochondriale de Ca^{2 +} rétention et Ca^{2 +}-trigged gonflement mitochondrial.

Capacité de rétention en ca^{2 +} est la mesure de la capacité des mitochondries de calcium cytosolique de l’absorption. Mitochondries peuvent mettre en mémoire tampon le calcium libre cytosolique et régulent les processus cellulaires dépendant du calcium par l’absorption de calcium sous forme de précipités inactives. Capacité altérée de Ca^{2 +} rétention se produit dans les phénomènes de stress associés à la limitation de l’énergie et de^4,maladies neurodégénératives voire⁵. Les mitochondries isolées ou cellules perméabilisées digitonine peuvent être utilisés pour identifier la capacité de rétention Ca^{2 +} , et la capacité élevée d’accumuler Ca^{2 +} par les mitochondries isolées avec le glutamate supplementaires et le malate n’est pas effectuée par le procédure d’isolement mitochondrial⁶. Une quantité titrée de digitonine devrait être utilisée pour permeabilize les membranes plasmiques des différents types de cellules. Le sel de hexapotassium de Ca^{2 +}-liaison colorant fluorescent vert, un Ca^{2 +}-cellule-imperméants sensible indicateur visible de la lumière-excitables, a été largement utilisé⁷. Ca^{2 +}-vert colorant fluorescent est un indicateur de faible affinité et utilisée pour montrer que des concentrations^{2 +} Ca libre intracellulaires continuent d’augmenter au cours de reliure prolongée de stimulations (5 min)⁸. Cette méthode était moins sensible que la technique du filtre radioactif, mais a été grandement simplifiée. Les autres Ca^{2 +} élève fluorescence verte de calcium et l’absorption de Ca^{2 +} par les mitochondries retourne la fluorescence au niveau de référence. Des additions séquentielles de Ca^{2 +} ont été faites jusqu’à ce que les mitochondries n’a pas d’absorption extramitochondrial Ca^{2 + 9}. Un lecteur de microplaques de fluorescence peut être utilisé pour signaler en permanence la fluorescence verte de calcium.

Après accumulation de Ca^{2 +} , les mitochondries dépolarisé, libéré Ca^{2 +} dans le milieu et a commencé à enfler. Ca^{2 +}-a déclenché des mitochondries gonflement est utilisé pour indiquer l’ouverture du mPTP. La microscopie électronique et la diminution de lumière absorbance à 540 nm peut être utilisé pour mesurer le Ca^{2 +}-déclenchée mitochondrial gonflement^10,11. Volume de mitochondries peut être directement déterminé par l’angle avant diffusion de la lumière¹², où la diminution de l’absorbance reflète gonflement passif de la matrice mitochondriale.

Ici, nous illustrons la méthodologie afin d’examiner la capacité mitochondriale de Ca^{2 +} rétention et Ca^{2 +}-a déclenché un gonflement mitochondrique en mitochondries isolées des cellules SH-SY5Y.