Mitocondrial Ca^{2 +} retenção capacidade do ensaio e Ca^{2 +}-provocou inchaço mitocondrial do ensaio

As mitocôndrias são os principais órgãos celulares para produzir cerca de 95% do ATP usado nas células de mamíferos por fosforilação oxidativa. É relatado que o sequestrado micromolar concentração de Ca^{2 +} pela mitocôndria, a presença de ADP e fosfato inorgânico pode ser usado para fosforilar ADP a síntese de ATP¹. Quando a concentração de citosólico Ca^{2 +} vai acima de um limite, a mitocôndria pode absorção Ca^{2 +} rapidamente e efluxo isso lentamente. Assim, as mitocôndrias funcionamento podem influxo o aumento citosólico Ca^{2 +}. Irrelevante para a participação na fosforilação oxidativa, o mitocondrial Ca^{2 +} também participar os sinais de cálcio citosólico e ativar o mecanismo de apoptose mitocondrial induzindo a abertura do mPTP no interno mitocondrial membrana². Foi amplamente reconhecido que elevação anormal de intracelular Ca^{2 +} pode induzir edema maciça mitocondrial abrindo o mPTP³. Assim, o presente protocolo tem por objetivo avaliar a função mitocondrial através da quantificação da capacidade mitocondrial Ca^{2 +} de retenção e Ca^{2 +}-trigged inchaço mitocondrial.

CA^{2 +} capacidade de retenção é a medição da capacidade das mitocôndrias de cálcio citosólico de captação. As mitocôndrias podem buffer o cálcio citosólico livre e regulam processos celulares de cálcio-dependente pela absorção de cálcio na forma de precipitados inativos. Capacidade prejudicada Ca^{2 +} retenção ocorre em fenômenos de estresse associados com limitação de energia e de^4,de doenças neurodegenerativas até⁵. Mitocôndrias isoladas ou células digitonin-permeabilizado podem ser usadas para identificar a capacidade de Ca^{2 +} de retenção, e a elevada capacidade de acumular Ca^{2 +} por mitocôndrias isoladas com o glutamato additonal e malato não é efectuada pelo procedimento de isolamento mitocondrial⁶. Uma quantia titulada de digitonin deve ser usada para permeabilize as membranas de plasma de diferentes tipos de células. O sal de hexapotassium de Ca^{2 +}-ligação corante fluorescente verde, uma Ca^{2 +}-impermeant-célula visível luz-excitável indicador sensível, tem sido amplamente utilizado⁷. CA^{2 +}-ligação verde tintura fluorescente é um indicador de baixa afinidade e usado para mostrar que intracelular livre Ca^{2 +} concentrações continuarem a subir durante a prolongada de estímulos (5 min)⁸. Este método era menos sensível do que a técnica de filtro radioativo mas foi bastante simplificado. O adicional Ca^{2 +} eleva a fluorescência verde do cálcio e da Ca^{2 +} adopção pelas mitocôndrias retorna a fluorescência de base. Adições sequenciais de Ca^{2 +} foram feitas até as mitocôndrias não conseguiram captação extramitochondrial Ca^{2 + 9}. Um leitor de microplacas de fluorescência pode ser usado para relatar continuamente a fluorescência verde de cálcio.

Após o acúmulo de Ca^{2 +} , mitocôndrias despolarizada, liberado Ca^{2 +} para o meio e começaram a inchar. CA^{2 +}-desencadeada mitocôndrias inchaço é usado para indicar a abertura do mPTP. Microscopia eletrônica e a diminuição da luz absorbância em 540 nm pode ser usado para medir o Ca^{2 +}-desencadeada mitocondrial inchaço^10,11. Volume de mitocôndrias pode ser diretamente determinada pelo ângulo frente espalhamento de luz¹², onde diminui em absorvância reflete passivo inchaço da matriz mitocondrial.

Aqui, podemos ilustrar a metodologia para examinar a capacidade mitocondrial Ca^{2 +} de retenção e Ca^{2 +}-provocou inchaço mitocondrial em mitocôndrias isoladas de SH-SY5Y de células.