dan Polyketomycin kullanma A Gösteri: Its Biyosentetik Gen kümesi için bir Doğal Ürün dan<em> Streptomyces diastatochromogenes</em> Tü6028

Antibiyotik Mülkiyet ile Doğal Ürün 1. Kimlik "OSMAC (bir suş-çok bileşikleri) yaklaşımı" 13 aşağıdaki farklı koşullar altında bir mikroorganizmanın (örneğin zaman, sıcaklık, pH, medya) Yetiştirmek. bir bileşiğin üretimi gözlendiği bir orta seçin. Aşağıdaki koşullar altında Streptomyces diastatochromogenes Tü6028 yetiştirmek MS plakaları üzerinde Streptomyces diastatochromogenes Tü6026 suşu büyütün (soya unu 20 g D-mannitol, 20 g, MgCl2 10 mM,% 1.5 ağar, musluk suyu 1 L). bir spiral bir Erlenmeyer şişesi içinde, küçük bir 20 mL sıvı TSB ortamı içinde, bu soyu sporlarının döngü (ön kültür ortamı triptik soya suyu 30 g, musluk suyu 1 L, pH 7.2) aşılamak. bir döner sallayıcı (28 ° C, 180 rpm, 2 gün) çalkalanır. 100 ml HA ortamında (glükoz 4 g, maya ekstresi, 4 g, malt ana kültürü inoküleön kültürün 2 mL, 10 g, musluk suyu 1 L, pH 7.2) ekstrakte edin. Kültür, 180 rpm'de bir döner sallayıcı üzerinde 6 gün boyunca 28 ° C 'de streyn. Ham ekstrenin hazırlanması santrifüj Hasat hücreleri (10 dk, 3000 xg). Bir sonraki adımlar için bir davlumbaz altında organik çözücüler anlaştım. miselyumdan bileşiği ekstre için, tekrar süspansiyon aseton iki kat hacminde hücre ve 30 dakika, 180 rpm'de bir tüp içinde çalkalanır. Ticari filtre kağıdından sıvı filtre edin ve 40 ° C ve 550 bar, döner bir buharlaştırıcı ile aseton buharlaştırılır. : etil asetat, 20 mL su içinde çözülür özü (1: 1) ve 180 rpm'de 30 dakika için bir ayırma hunisi içerisinde çalkalayın. kültür ortamından bileşiği ekstre için, 1 N HCI ilave edilerek pH 4.0 kültür suyu ayarlayın. 100 ml etil asetat ilave edin ve 30 dakika, 180 rpm'de bir ayırma hunisinde sallayın. Etil asetat fazı toplayın ve çürüme ile buharlaşması 40 ° C'de ve 240 barda li buharlaştırma. HPLC ile yapılan ham ekstrakt analizi , 1 mL MeOH içinde çözülür özleri 0.45 um gözenek boyutlu filtre içinden filtre ve yüksek performanslı sıvı kromatografisi (HPLC) 14 çalıştırın. Polyketomycin durumunda, bir C18 Kolon öncesi (4.6 x 20 mm 2) ve bir C18 kolonu (4.6 x 100 mm x 2) HPLC sistemi donatılması. H% 20 ile% 95 arasında değişen asetonitril +% 0.5 asetik asit arasındaki bir doğrusal eğimi kullanarak 2 O +% 0.5 asetik asit (akış hızı: 0.5 ml dak-1). Not: Polyketomycin 25.9 dakikalık bir tutma süresine sahip (Şekil 1A bakınız). UV / vis spektrumu 262 nm ve 359 nm 242 nm, 282 nm, 446 nm ve minimum de maksimumu vardır (Şekil 1B bakınız). Negatif modus 863,2 [MH] + bir kitle – (Şekil 1C bakınız) tespit edilebilir. "Src =" / files / ftp_upload / 54952 / 54952fig1.jpg "/> Şekil 1: Polyketomycin LC / MS analizi. 6 gün Streptomyces diastatochromogenes Tü6028 büyütüldükten sonra ham ekstre (A) olarak hazırlanmıştır HPLC kromatogramı (λ = 430 nm). Polyketomycin / vis spektrumları Polyketomycin 25.9 dakika (B), bir UV Tutma süresi vardır. Negatif yöntemlerinde de Polyketomycin (C) Kütle spektrumu. M / z 863,2 ile ana pik [MH] + -. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız. Antibiyotik aktivitesinin tanımlanması disk difüzyon deneyi kullanılarak Gram-pozitif bakteriler, Bacillus subtilis gibi test suşları inoküle (LB ortamında LB 20 g, musluk suyu 1 L pH 7.4) ve TSB ortamı diğer Streptomyces soyları (; triptik soya suyu 30 g, musluk suyu 1 L, pH 7.2), Gram-negatif bakteriler Escherichia LB ortamında coli () ve YPD ortamı olarak ortam mantar suşları (; maya özü, 10 g, pepton 20 g, glukoz 20 g, musluk suyu 1 L, pH 7,4). Test suşu ön kültürün 100 mcL alın ve ilgili agar plakaları üzerine onları yayıldı. steril kağıt diskler üzerinde metanol (alternatif olarak, su ya da DMSO) ve pipet 20-50 uL 500 uL ham ekstresi ya da saflaştırılmış bileşik içinde çözülür. tezgaha altında 30 dakika süreyle kuru kağıt diskler ve test kültürleri ile plakalar üzerine koydu. Bir negatif kontrol (çözücü) ve pozitif kontrol hazırlanması (antibiyotik, örneğin apramisin [1 mg]). Test suşları gözle görülür yetiştirilen kadar yeterli koşullar altında inkübe ve belirgin olursa, inhibisyon zonu belirler. E. coli ve Bacillus sp inkübe edin. 16 saat 37 ° C'de, Streptomyces sp. 2-4 gün süreyle 28 ° C 'de, mantar soyu (kesin testi soy esas bağlıdır)t, 2 gün boyunca 30 ° C). Bileşik 2. Büyük çaplı ekstraksiyon, arıtılması ve yapısının açıklanması (Suya 1 L, pH 7.2 dokunun glikoz 4 g, maya özü 4 g, malt özü 10 g) 5 L HA ortamında S. diastatochromogenes Yetiştirmek. 150 ml HA ihtiva eden ortam 30 x 500 mL'lik Erlenmeyer şişelerinde ön-kültüre bırakılmıştır 2 mL inoküle. 180 rpm'de döner çalkalayıcıda, 6 gün boyunca 28 ° C'de soy inkübe edin. santrifüj Hasat hücreleri (10 dk, 15.000 xg, RT) ve etil asetat kullanılarak özü bileşikleri (bölüm 1.3). Şekil 2: yapı aydınlatmalarında için iş akışı. proses soyunun (1) işleme, (2) ekstraksiyon, katı faz ekstraksiyonu (SPE), ince tabaka kromatografisi (TLC), preparatif yüksek performanslı sıvı kromatografisi (HPLC), boyut (3) ile saflaştırma içermesidirkütle analizi (MS), nükleer manyetik rezonans (NMR) ve X-ışını ölçümleri ile dışlama kromatografisi (SEC) ve (4) yapısının açıklanması,. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız. Polyketomycin saflaştırılması Not: arıtılması ve yapısının açıklanması işlemi, Şekil 2'de gösterilmektedir. H2O içinde% 30 ila% 100 MeOH kadar% 10 -stepwise MeOH gradyanı, her durum için, 100 mL kullanılarak bir C 18 katı faz ekstraksiyonu (SPE), kolon Ham özü fraksiyonlanması. (1: 7) ve elüsyon sistemi hazırlayıcı ince-tabaka kromatografisi (TLC), 15 ile CH2C! 2 / MeOH ayrıca, bileşimin ihtiva fraksiyonu saflaştırılır. Hazırlayıcı HPLC 16 ile bileşiğin saflaştınlır. ve, bir C18 Kolon öncesi (9.4 x 20 mm 5 um) ile HPLC sistemi donatmakAna kolonu (5 um, 9.4 x 150 mm). H% 20 ila% 95 2 O +% 0.5 asetik asit kadar asetonitril +% 0.5 asetik asit meyili kullanarak (akış hızı: 2.0 mL / dakika). Çözücüler ve diğer küçük safsızlıkları uzaklaştırmak için, MeOH 17 bir kolon kullanılarak boyut dışlama kromatografisi ile son saflaştırma adımı gerçekleştirmek. Nihai saf bileşiği toplamak ve 40 ° C ve 240 bar, döner buharlaştırma ile MeOH buharlaşır. yapı aydınlatılması DMSO-d6 içinde (makineye bağlı olarak) 600-700 uL saf bileşiği (en fazla 2 mg), kayıt 1D NMR (1H, 13 ° C) ve 2D NMR (HSQC, HMBC, 1H 1 H çözülür bir NMR spektrometresi 18 COSY) spektrumları. DMSO-d6 kullanılarak δ değerleri (ppm) cinsinden kimyasal deplasmanlar ifade eder. Yüksek çözünürlüklü kütle spektrumu (HRESI-MS) yüksek çözünürlük kullanarak polyketomycin 19. kaydedinkütle spektrometresi. NMR ve MS veri analizi 10 sonuçlarının yorumlanması ile yapısını aydınlatmak. 3. Yeni İzole Bileşik Biyosentetik Modeli Propose İzole bileşiğin yapısını analiz ve biyosentezi dahil olabilir enzimler, tahmin. Poliketid (tip I, II ya da III), ribozomal olmayan peptid sentezi, lantipeptide terpenoid veya şeker metabolizması yolu 8 bunları atar. Örnek polyketomycin tetrasiklik parçasının, iki monosakkaritler ve dimetil salisilik asit: bariz tek kısımlarının içine yapısını Subdivide. kısımlardan türetilen durumunda, bu bul: tetrasiklik kısmı bir poliketit sentaz türünden türetilmiş olabilir II ve dimetil salisilik asit yarımı yinelemeli bir poliketit sentaz tip I ile elde edilebilir 6-deoxysugars iki şeker bölümlerine, , synthesi olabilirZed biyosentez sırasında TDP-glukoz-4,6-dehidrataz ve iki glikosiltransferazların muhtemelen bağlanmış ilgili glikozdan (bakınız Şekil 3) 8. kümede varsayılan genleri tahmin. birimlerini bağlayan olarak, hem de değiştirme ve molekül dikiş olarak, tek kısımların sentezinde rol oynayan enzimlerin düşünün. Polyketomycin biyosentetik gen kümesi muhtemelen (genişletici birimleri bağlamak için bu nedenle en az bir ACP, KS α und KS β) bir poliketid sentaz tip II kodlayan genleri içeren bir iteratif poliketid sentaz tip I (en azından ACP, AT, KS), bir TDP-glukoz-4,6-dehidrataz (adım için gerekli: glikoz → deoksiglukoz) ve iki glıkosıltransferaz (aglikona iki şeker monomerleri bağlayan) 8. Şekil 3: Polyketomycin divId deki YapıTek Yapı Taşları içine ed. Polyketomycin β-D-amicetose ve α-L-axenose (MDP-glukoz-4,6, iki deoksi şeker kısımları ile bağlantılı bir tetrasiklik decaketid (PKS tip II) ve dimetil salisilik asit (yinelemeli PKS tip I) oluşmaktadır ) dehidrataz ve iki glikosiltransferaz gerektirir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız. 4. Genomu Sıralama / Madencilik Yeni nesil dizileme Illumina, 454, piro veya katı 20 gibi gelecek nesil dizileme teknolojileri ile genomik DNA sekansı. Tek hizalayın bir referans dizisi okur veya de novo araya. NOT: S. diastatochromogenes Tü6028 genomu Bielefeld Üniversitesi Biyoteknoloji Merkezi (CeBiTec) de sıralandı. Tüm taslak genomuna monte edilmiştir okur7.9 Mb. genom madenciliği Örnek NCBI Prokaryotik Genom Açıklaması Boru Hattı 21,22 için, RAST 23,24,25, Prokka (hızlı prokaryotik genom açıklama) 26 veya GenDB 27 (hızlı açıklama alt teknolojisini kullanarak) kullanımı ile açık okuma çerçeveleri (ORF) ara. Bu programlar da onların işlevlerini öneriyoruz. S. analizi 7.000 'den fazla ORF belirlenmesine yol açmıştır Tü6028 taslak genom dizisi diastatochromogenes. Run özel BLAST (Temel Lokal Hizalama Arama Aracı) analizi, diğer benzer genlerin ve katalitik etki 28,29,30 ile hizalanmalarda gibi daha fazla bilgi almak için. AntiSMASH 31,32,33, NaPDoS 34 ve NRPSpredictor 35,36 gibi ikincil metabolit gen küme çalışma programlarının belirlenmesi için. Streptomyces diastatochromogenes antiSMASH 31,32,33 kimliğin taslak genomunda22 gen kümeleri fied. enzimatik yol (lar) için olası bir gen kümeleri (poliketid sintazı (tip I, II ya da III), ribozomal olmayan peptid sintetaz, lanthipeptide terpenoid, şeker metabolizması …) analiz eder. bileşiğin sentezinde rol oynayabilecek genleri içeren küme (ler) ara (Bölüm 3). S. diastatochromogenes açıklamalı küme 2 poliketid sentaz tip II genleri, üç poliketid sentaz tip I genleri, bir TDP-glikoz-4,6-dehidrataz gen ve iki glıkosıltransferaz genleri (bakınız Şekil 4) içerir. küme içinde tek genler odaklanın. PKS tip I ve NRPS açiltransferazlar ve adenylation etki özgüllüğü ve böylece tek genişletici birimleri dahil edilmesi için, tahmin edilebilir. Ayrıca molekülü ile birleşmiş genişletici biriminin sırasını karşılaştırın. antiSMASH 31,32,33 ayrıca MIBiG veritabanına 37 bir bağlantı ile, zaten bilinen bileşiklerin benzer kümeleri gösterir. </li> bu bileşikler ile bileşiğin yapısını karşılaştırmak ve benzerlikleri kontrol edin. Şekil 4: S. Polyketomycin Biyosentetik Gen Kümesi ve Diğer Kümeleri Genel Bakış antiSMASH Çıktı Tü6028 diastatochromogenes. (A) S. genomu tahmin biyosentetik gen kümeleri genel Tü6028 diastatochromogenes; Hedeflenen genleri ile (B) Küme 2 Polyketomycin biyosentetik gen kümesi. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız. Biyosentetik Gen Cluster 5. Doğrulama bileşiğin biyosentezi için açık ve önemli (esansiyel) fonksiyonları ile bir genin arayın. polyketo doğrulanması içinPKS tip II ketosintaz a kodlayan gen pokPI bil gen kümesi, çerçeve -deletion dışı bir (Şekil 5B bakınız) tarafından seçilen ve inaktive edildi. Seçenek olarak ise, bir iç fragmanının klonlanmasıyla geni kesme (Şekil 5C bakınız). Şekil 5: Tek Crossover tarafından Gen Kümesi doğrulanması. (A), yerel genin işlevsel bir protein çevirisi yol açar; Intihar vektörü içine içi silme olan genin (B) klonlanması hedeflenen gen ve fonksiyonel olmayan proteininin bunu takip eden çeviride bir çerçeve kayması ile sonuçlanan tek bir geçit yol; Intihar vektörü içine genin bir iç fragmanının (C) klonlanması geni ve işlevsel olmayan bir protein daha sonra bir çeviri kesme yol açar. oriT: t kökeniransfer; antibiyotik R: antibiyotik direnci. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız. Tek geçiş yapısının klonlanması Primerleri pokPI_for ve pokPI_rev ile PCR 38 tarafından pokPI ihtiva eden bir parça yükseltmek. İntihar vektörüne klon PCR ürünü, pKC1132 39 (R apramisin [50 mg / ml]). Intihar vektörü Streptomyces suşu içinde replike mümkün değildir ve bu nedenle apramisin karşı koymak için homolog rekombinasyon ile hedef gen içine entegre sahiptir. Isı şok dönüşümü 40 tarafından host klonlama E. coli içine vektör aktarın. Alkalin lizis 41 ile vektör izole edin. fragmanı içinde kesen bir tek kesici kısıtlama enzimi ile vektör DNA sindiremez. pokPI genE ile sindirildi Enzim Kpn I 5 '→ 3' polimeraz aktivitesi ve 3 '→ 5' eksonükleaz aktivitesi olan büyük DNA polimeraz I (Klenow) fragmanı ile sindirilmiş vektör DNA'sı tedavi edin. Yapışkan uçların kuntleştırılmesını ve sonra religasyon dört bazdan kaybına neden olur. Plazmid DNA, 41 yalıtma ve sınırlama sindirim ve sıralama ile daha analiz, tek koloniler toplama, E. coli XL1 Blue içine adımlar dönüşüm bu üslerin kaybı olup olmadığını kontrol edin. Tek geçit çekimi Streptomyces içine inşa Isı şok dönüşümü 40 E. coli ET12567 pUZ8002 42 (kanamisin R) içine silinmesi ile pokPI genini (pKC1132_ pokPI del) içeren intihar vektörü aktarın. 100 mL LB ortamında inkübe hücreleri (kanamisin 50 ug ml -1, apramisin 50 mg ml -1 </sup>) Karışımı gece boyunca 37 ° C. santrifüj ile hasat hücreleri (3,000 xg, 10 dakika, 4 ° C) ve 50 ml LB ortamı içinde yeniden süspanse edilerek hücreler iki kez yıkayın. Son olarak, LB ortamı 2 x 500 uL tekrar süspansiyon hücreleri. Mix 500 uL E. coli pUZ8002 pKC1132_ pokPI del 500 uL Streptomyces diastatochromogenes kültürü ile (alternatif sporlar kullanın). MS plakaları üzerinde karışım (soya unu 20 g D-mannitol, 20 g, MgCl2 10 mM,% 1.5 ağar, musluk suyu 1 L) yayıldı. 28 ° C'de 20 saat süreyle inkübe edin. apramisin (1.25 mg) ve 1 mL su içinde çözülmüş fosfomisin (5 mg) ile her plaka Yerleşimi ve kurumaya bırakın. exconjugants görünene kadar 28 ° C 'de pek çok gün süre ile inkübe edin. Tek geçiş mutantlar kontrol 20 ml TSB ortamı (50 mg mL apramisin-1) tek exconjugants inoküle ve üç gün boyunca 180 rpm'de 28 ° C'de inkübe. Genomik DNA 43 yalıtmak ve PCR ile pokPI geninin kesintiye kontrol edin. 100 ml HA ortam içinde belirlenmiş gen kesintisiz Streptomyces vahşi tip suş ile tek klonlar inoküle ve 28 ° C ve 180 rpm'de 6 gün süreyle inkübe edilir. Ham özü (bölüm 1.3) ayıklayın. HPLC-MS analizi ile bileşik üretimini kontrol edin (bölüm 1.4). HPLC kromatogramı karşılık gelen tepe ve bileşik kütlesi daha fazla tespit olmamalıdır (bakınız Şekil 6). Şekil 6: İnaktif pokPI Gene S. diastatochromogenes HPLC analizi. S. ham ekstre HPLC kromatogramıdır (λ = 430 nm) kesintiye pokPI -gen (aşağıda) WT (üst) ve mutant suşu diastatochromogenes. mutant suş artık polyketomycin üretmez.Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.