Da un prodotto naturale al suo grappolo Biosynthetic Gene: Una dimostrazione che utilizzino Polyketomycin da<em> Streptomyces diastatochromogenes</em> Tü6028

1. Identificazione di un prodotto naturale con proprietà antibiotico Coltivare un microrganismo in condizioni diverse (ad esempio, tempo, temperatura, pH, media) in seguito alla "OSMAC (un ceppo-molti composti) approccio" 13. Selezionare un mezzo in cui si osserva la produzione di un composto. Coltivare Streptomyces diastatochromogenes Tü6028 nelle seguenti condizioni Grow Streptomyces diastatochromogenes ceppo Tü6026 su piastre MS (farina di soia 20 g, D-mannitolo 20 g, MgCl 2 a 10 mm, agar 1,5%, l'acqua del rubinetto 1 L). Seminare un piccolo anello delle spore di questo ceppo in 20 ml di media TSB liquido (Tryptic Soy brodo 30 g, l'acqua del rubinetto 1 L, pH 7,2; media precoltura) in una beuta con una spirale. Agitare il recipiente su un agitatore rotante (28 ° C, 180 rpm, 2 giorni). Seminare la cultura principale a 100 ml di mezzo HA (glucosio 4 g, estratto di lievito 4 g, maltoestrarre 10 g, acqua di rubinetto 1 L, pH 7.2) con 2 mL di precoltura. Culture ceppo a 28 ° C per 6 giorni su un agitatore rotante a 180 rpm. Preparazione dell'estratto grezzo Celle di raccolta mediante centrifugazione (10 min, 3000 XG). Per passi successivi gestire solventi organici sotto una cappa aspirante. Per l'estrazione composto dal micelio, risospendere le cellule in un duplice volume di acetone e agitare con un tubo per 30 min, 180 rpm. Filtrare il liquido attraverso carta da filtro commerciale e si evapora l'acetone da evaporatore rotante a 40 ° C e 550 bar. Sciogliere l'estratto in 20 mL di acqua: acetato di etile (1: 1) e agitare in un imbuto separatore per 30 min a 180 rpm. Per l'estrazione composti dal mezzo di coltura, regolare il brodo di coltura a pH 4,0 mediante aggiunta di 1 M HCl. Aggiungere 100 mL di acetato di etile e agitarla in un imbuto separatore per 30 min, 180 giri al minuto. Raccogliere fase di acetato di etile e far evaporare da marciume evaporazione ary a 40 ° C e 240 bar. Analisi dell'estratto grezzo mediante HPLC Sciogliere gli estratti in 1 ml MeOH, filtrarli attraverso un filtro con 0,45 micron pori ed eseguire la cromatografia liquida ad alta prestazione (HPLC) 14. Nel caso di polyketomycin, dotare il sistema HPLC con una precolonna C18 (4,6 x 20 mm 2) ed una colonna C18 (4,6 x 100 mm 2). Utilizzare un gradiente lineare di acetonitrile + 0,5% di acido acetico che vanno dal 20% al 95% in H (portata: 0,5 mL min -1) acetico 2 O + 0,5%. NOTA: Polyketomycin ha un tempo di ritenzione 25,9 min (vedere Figura 1A). Lo spettro UV / vis ha massimi a 242 nm, 282 nm, 446 nm e minimi a 262 nm e 359 nm (vedere Figura 1B). Nel modus negativo una massa di 863,2 [MH] – è rilevabile (vedi Figura 1C). "Src =" / files / ftp_upload / 54952 / 54952fig1.jpg "/> Figura 1: LC / MS Analisi Polyketomycin. (A) HPLC cromatogramma (λ = 430 nm) dell'estratto grezzo dopo coltura di Streptomyces diastatochromogenes Tü6028 per 6 giorni. Polyketomycin ha un tempo di ritenzione 25,9 min (B) UV / vis spettri di Polyketomycin. (C) Massa spettri Polyketomycin nel modus negativo. Picco principale con m / z 863,2 [MH] -. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura. Identificazione della attività antibiotica mediante saggio disco diffusion Seminare i ceppi di test come Gram-positivi subtilis batteri Bacillus (in terreno LB; LB 20 g, l'acqua del rubinetto 1 L, pH 7,4) e altri ceppi Streptomyces (in media TSB; brodo di soia trittico 30 g, l'acqua del rubinetto 1 L, pH 7.2), Batteri Gram-negativi Escherichia coli (in terreno LB) e ceppi fungini (in media come mezzo YPD; estratto di lievito 10 g, 20 g peptone, glucosio 20 g, rubinetto 1 L, pH 7,4). Prendete 100 ml di prova ceppo precoltura e diffonderli su rispettive piastre di agar. Sciogliere l'estratto grezzo o composto purificato in 500 ml di metanolo (in alternativa acqua o DMSO) e pipetta 20-50 microlitri su dischi di carta sterili. dischi di carta a secco per 30 minuti sotto il banco di lavoro e metterle sulle piastre con colture di prova. Preparare un controllo negativo (solvente) e un controllo positivo (antibiotici, per esempio AMP [1 mg]). Incubare le piastre in condizioni adeguate fino a quando i ceppi di test sono cresciuti visibilmente e determinare la zona di inibizione, se apparente. Incubare E. coli e Bacillus sp. a 37 ° C per 16 h, Streptomyces sp. a 28 ° C per 2-4 giorni, ceppo fungino (prevalentemente a carico esatto ceppo di prova) unat 30 ° C per 2 giorni). 2. Large Scale di estrazione, purificazione e struttura chiarimento del Compound Coltivare S. diastatochromogenes in media 5 L HA (glucosio 4 g, estratto di lievito 4 g, estratti di malto 10 g, l'acqua del rubinetto 1 L, pH 7,2). Seminare 2 ml del precoltura a 30 x 500 ml Erlenmeyer palloni contenenti 150 ml HA media. Incubare la deformazione a 28 ° C per 6 giorni su un agitatore rotante a 180 rpm. Celle di raccolta mediante centrifugazione (10 min, 15.000 XG, RT) ei composti estratto utilizzando acetato di etile (vedere paragrafo 1.3). Figura 2: Flusso di lavoro per la struttura chiarimento. Il procedimento comprende (1) la coltivazione del ceppo, (2) estrazione, (3) la purificazione mediante estrazione in fase solida (SPE), cromatografia su strato sottile (TLC), cromatografia liquida preparativa ad alta prestazione (HPLC), dimensionecromatografia di esclusione (SEC) e (4) Struttura delucidazione mediante analisi di massa (MS), la risonanza magnetica nucleare (NMR) e le misure X-ray. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura. Purificazione di Polyketomycin NOTA: Il processo di purificazione e struttura delucidazione è mostrata in figura 2. Frazionare estratto grezzo da una colonna di estrazione in fase solida C18 (SPE) utilizzando un gradiente di -stepwise MeOH 10% dal 30% al 100% MeOH in H 2 O, 100 mL per ogni condizione. Purificare la frazione compound contenente ulteriormente mediante cromatografia preparativa su strato sottile (TLC) 15 usando CH 2 Cl 2 / MeOH (7: 1) come sistema di eluizione. Purificare il composto mediante HPLC preparativo 16. Dotare il sistema HPLC con una precolonna C18 (5 micron; 9,4 x 20 mm) e uncolonna principale (5 micron; 9,4 x 150 mm). Utilizzare un gradiente di acido acetico acetonitrile + 0,5% dal 20% al 95% in acido acetico H 2 O + 0,5% (portata: 2,0 mL / min). Per rimuovere solventi e altre piccole impurità, eseguire un ultimo passo purificazione mediante cromatografia ad esclusione sterica utilizzando una colonna in MeOH 17. Raccogliere il composto puro finale ed evaporare MeOH per evaporazione rotante a 40 ° C e 240 bar. struttura delucidazione Sciogliere il composto puro (più di 2 mg) in 600-700 ml (a seconda della macchina) di DMSO d 6, registrare 1D NMR (1 H, 13 C) e 2D NMR (HSQC, HMBC, 1 H 1 H COSY) spettri su uno spettrometro NMR 18. Esprimere spostamenti chimici nei valori δ (ppm) utilizzando DMSO d 6. Registrare un spettro di massa ad alta risoluzione (HRESI-MS) 19 di polyketomycin con una ad alta risoluzionespettrometro di massa. Chiarire la struttura per l'interpretazione dei risultati di analisi dati NMR e MS 10. 3. Proporre Biosynthetic modello della nuova composto isolato Analizzare la struttura del composto isolato e predire enzimi, che possono essere coinvolti nella biosintesi. Assegnarli a Polichetide (tipo I, II o III), sintesi di peptidi non ribosomiale, lantipeptide, terpenoid, o zucchero metabolismo percorso 8. esempio polyketomycin Suddividere la struttura in evidenti singole frazioni: frazione tetraciclici, due monosaccaridi e l'acido salicilico dimetil. Scopri, dove le frazioni possono essere derivate da: La porzione tetraciclici potrebbe essere derivato da un tipo polyketide sintasi II e la frazione dimetil acido salicilico potrebbe essere derivato da un iterativo Polichetide tipo sintetasi I. Le due frazioni di zucchero, che sono 6-deoxysugars , potrebbe essere SynthesiZed dal glucosio che coinvolge un TDP-glucosio-4,6-dehydratase durante la biosintesi e fissato probabilmente da due glicosiltransferasi (vedi figura 3) 8. Prevedere geni putativi del cluster. Si pensi enzimi coinvolti nella sintesi delle singole porzioni, nel collegare le unità, nonché nel modificare e personalizzare la molecola. Il cluster genico biosintetico di Polyketomycin contiene la maggior parte probabilmente geni che codificano un tipo polyketide sintasi II (quindi almeno un ACP, KS α und KS β per il collegamento di unità di estensione), un iterativo di tipo Polichetide sintasi I (almeno ACP, AT, KS), una TDP-glucosio-4,6-deidratasi (necessario per il passo: il glucosio → deossiglucosio) e due glicosiltransferasi (allegando due monomeri di zucchero verso l'aglicone) 8. Figura 3: Struttura di Polyketomycin Dividcato in singoli blocchi di costruzione. Polyketomycin è composto da un decaketid tetraciclici (PKS tipo II) e un acido salicilico dimetil (iterativo PKS tipo I), collegati da due porzioni deossizuccheri β-D-amicetose e α-L-axenose (NDP-glucosio-4,6- dehydratase e due glycosyltransferase richiesto). Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura. 4. Genome Sequencing / Mining Generazione sequenziamento di prossima Sequenziare il DNA genomico da tecnologie di sequenziamento di nuova generazione, come Illumina, 454 pyrosequencing o solido 20. Allineare singolo si legge in una sequenza di riferimento o assemblare de novo. NOTA: Il genoma di S. diastatochromogenes Tü6028 è stato sequenziato presso il Centro di Biotecnologie (CeBiTec) presso l'Università di Bielefeld. Tutte le letture sono state assemblate a un progetto di genomadi 7,9 Mb. genoma mineraria Cerca open reading frame (ORF) per l'uso di, per esempio NCBI Prokaryotic annotazione genomica Pipeline 21,22, RAST (rapida annotazione utilizzando la tecnologia del sottosistema) 23,24,25, Prokka (rapido procariotico annotazione del genoma) 26 o 27 GenDB. Questi programmi propongono anche le loro funzioni. L'analisi del S. diastatochromogenes Tü6028 sequenza del genoma progetto portato all'identificazione di oltre 7.000 ORF. Eseguire BLAST specifico (Base locale Allineamento strumento di ricerca) di analisi per ottenere ulteriori informazioni come allineamenti con altri geni simili e domini catalitici 28,29,30. Per l'identificazione del gene metabolita eseguire programmi di cluster secondari come antiSMASH 31,32,33, 34 e NaPDoS NRPSpredictor 35,36. Nel progetto genoma di Streptomyces diastatochromogenes antiSMASH 31,32,33 identicato 22 cluster di geni. Analizzare i cluster di geni putativi per la loro via enzimatica (s) (Polichetide sintasi (tipo I, II o III), non ribosomiale peptide sintetasi, lanthipeptide, terpenoidi, metabolismo degli zuccheri …). Ricerca di cluster (s) contenente geni che potrebbero essere coinvolti nella sintesi del composto (vedi punto 3). A S. diastatochromogenes annotata gruppo 2 contiene Polichetide tipo sintasi II geni, tre Polichetide tipo sintasi I geni, un gene TDP-glucosio-4,6-deidratasi e due geni glicosiltransferasi (vedi Figura 4). Focus su singoli geni all'interno del cluster. Per PKS tipo I e NRPS la specificità di aciltransferasi e domini adenylation, e quindi l'incorporazione di unità singola diluenti, può essere previsto. confronta anche dell'ordine dell'unità extender incorporato con la molecola. antiSMASH 31,32,33 mostra anche gruppi simili di composti già noti, con un link al database di MIBiG 37. </li> Confrontare la struttura del composto con questi composti e controllare somiglianze. Figura 4: Uscita antiSMASH di Polyketomycin Biosynthetic Gene Cluster e panoramica dei altri cluster a S. diastatochromogenes Tü6028. (A) Presentazione di cluster di geni biosintetici previsti nel genoma di S. diastatochromogenes Tü6028; (B) Cluster 2 Polyketomycin cluster di geni biosintetico con i geni mirati. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura. 5. Verifica del Cluster Biosynthetic Gene Ricerca di un gene con funzioni ovvie e importanti (essenziali) per la biosintesi del composto. Per la verifica della polyketomycin gene cluster gene pokPI, che codifica per la α ketosynthase dal tipo PKS II, è stato selezionato e inattivato da un fuori della cornice -deletion (vedi Figura 5B). In alternativa, interrompere il gene clonando un frammento di interno (vedi Figura 5C). Figura 5: Verifica di un cluster di geni dal singolo Crossover. (A) gene nativo porta alla definizione di una proteina funzionale; (B) Clonaggio del gene con delezione interna in un vettore suicida conduce ad un singolo incrocio con un conseguente spostamento fotogramma nel gene bersaglio e la conseguente definizione di proteina non funzionale; (C) La clonazione di un frammento interna del gene in un vettore suicida porta ad un troncamento del gene e conseguente definizione di una proteina non funzionale. orit: origine delle transfer; antibiotico R: resistenza agli antibiotici. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura. Clonazione del costrutto singolo crossover Amplificare un frammento contenente pokPI mediante PCR 38 con primer pokPI_for e pokPI_rev. Prodotto Clone PCR al suicidio vettore pKC1132 39 (apramicina R [50 mg / ml]). Il vettore suicidio non è in grado di replicare nel ceppo Streptomyces e deve integrarsi nel gene bersaglio di ricombinazione omologa per fornire AMP-resistenza così. Trasferire il vettore in E. coli clonazione ospite da shock termico trasformazione 40. Isolare il vettore da alcalina lisi 41. Digerire il DNA di vettore con un singolo enzima di restrizione taglierina che taglia all'interno del frammento. Il pokPI gene stato digerito con enzima Kpn I. Trattare DNA vettore digerito con grande DNA polimerasi I (Klenow) frammento, che ha 5 '→ 3' attività della polimerasi e 3 '→ 5' esonucleasi-attività. Ottundimento delle estremità appiccicose e successiva religation porta alla perdita di quattro basi. Controllare per la perdita di queste basi per la trasformazione passi in E. coli XL1 Blu, raccogliendo singole colonie, isolando il loro DNA plasmide, 41 e analizzare ulteriormente restrizione digestione e sequenziamento. Coniugazione del singolo incrocio costruire in Streptomyces Trasferire il vettore contenente il gene suicida pokPI (pKC1132_ pokPI del) con delezione in E. coli ET12567 pUZ8002 42 (kanamicina R) da shock termico trasformazione 40. Incubare le cellule in 100 ml di LB mezzi (kanamicina 50 mg mL -1, AMP 50 mg mL -1 </sup>) Notte a 37 ° C. Celle di raccolta mediante centrifugazione (3.000 XG, 10 min, 4 ° C) e lavare le cellule due volte da risospendere in 50 ml di mezzi LB. Infine, Risospendere le cellule in 2 x 500 ml di LB media. Mescolare 500 ml di E. coli pUZ8002 pKC1132_ pokPI del con la cultura 500 microlitri di Streptomyces diastatochromogenes (in alternativa utilizzare le spore). Stendere l'impasto su piastre MS (farina di soia 20 g, D-mannitolo 20 g, MgCl 2 a 10 mm, agar 1,5%, l'acqua del rubinetto 1 L). Incubare le piastre per 20 ore a 28 ° C. Sovrapposizione ogni piatto con AMP (1,25 mg) e fosfomicina (5 mg) disciolti in 1 ml di acqua e lasciare asciugare. Incubare le piastre per diversi giorni a 28 ° C fino a quando exconjugants sono visibili. Controllare mutanti singolo di crossover Seminare singoli exconjugants in 20 mL TSB medio (AMP 50 mg mL -1) e incubare a 28 ° C per tre giorni e 180 giri al minuto. Isolare il DNA genomico 43 e verificare l'interruzione del gene pokPI mediante PCR. Seminare cloni singoli con interruzione del gene verificato e Streptomyces ceppo di tipo selvatico in 100 ml di mezzo HA e incubare per 6 giorni a 28 ° C e 180 giri al minuto. Estrarre il estratto grezzo (vedi paragrafo 1.3). Controllare la produzione di compound mediante analisi HPLC-MS (vedi paragrafo 1.4). Il picco corrispondente nel cromatogramma HPLC e la massa del composto non dovrebbero essere rilevabili più (vedere Figura 6). Figura 6: Analisi HPLC di S. diastatochromogenes con inattivato pokPI Gene. HPLC cromatogramma (λ = 430 nm) di greggio estratto di S. diastatochromogenes WT (in alto) e ceppo mutante con interrotto pokPI Ge (qui di seguito). Il ceppo mutante non produce polyketomycin più.Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.