Von einem natürlichen Produkt in seine Biosynthesegenclusters: Eine Demonstration Mit Polyketomycin aus<em> Streptomyces diastatochromogenes</em> Tü6028

1. Bezeichnung eines Naturprodukts mit Antibiotika Property Pflegen eines Mikroorganismus unter verschiedenen Bedingungen (zB Zeit, Temperatur, pH – Wert, Medien) im Anschluss an die "OSMAC (ein Stamm-viele – Verbindungen) Ansatz" 13. Wählen Sie ein Medium, in dem die Herstellung einer Verbindung beobachtet wird. Pflegen Streptomyces diastatochromogenes Tü6028 unter den folgenden Bedingungen Wachsen Streptomyces diastatochromogenes Tü6026 Stamm auf MS – Platten (Sojamehl 20 g, D-Mannit 20 g, MgCl 2 10 mM, Agar 1,5%, Leitungswasser 1 l). Impfen eine kleine Schleife der Sporen dieses Stammes in 20 ml Flüssigkeit TSB-Medium (tryptische Sojabrühe 30 g, Leitungswasser 1 l, pH 7,2; Vorkultur-Medium) in einem Erlenmeyerkolben mit einer Spirale. Schütteln Sie den Kolben auf einem Rotationsschüttler (28 ° C, 180 Umdrehungen pro Minute, 2 Tage). Impfen Hauptkultur in 100 ml HA-Medium (Glucose 4 g, Hefeextrakt 4 g, MalzExtrakt 10 g, Leitungswasser 1 l, pH 7,2) mit 2 ml der Vorkultur. Kultur der Stamm bei 28 ° C für 6 Tage auf einem Rotationsschüttler bei 180 Upm. Herstellung des Rohextrakts Ernte die Zellen durch Zentrifugation (10 min, 3.000 x g). Für die nächsten Schritte behandeln organischen Lösungsmitteln unter einer Abzugshaube. Für Verbindung Extraktion aus dem Myzel, resuspendieren Zellen in einem zweifachen Volumen Aceton und schütteln in einem Rohr für 30 min, 180 UpM. Filtern der Flüssigkeit durch kommerzielle Filterpapier und dampfe Aceton am Rotationsverdampfer bei 40 ° C und 550 bar. Man löst den Extrakt in 20 ml Wasser: Ethylacetat (1: 1) und schütteln Sie sie in einem Trenntrichter für 30 Minuten bei 180 Umdrehungen pro Minute. Für Verbindung Extraktion aus dem Kulturmedium, stellen Sie die Kulturbrühe auf pH 4,0 durch Zugabe von 1 M HCl. In 100 ml Ethylacetat und schütteln Sie sie in einem Scheidetrichter 30 min, 180 Umdrehungen pro Minute. Sammeln Sie Ethylacetatphase und verdunsten durch Fäulnis ary Verdampfung bei 40 ° C und 240 bar. Analyse des Rohextrakts durch HPLC Man löst die Extrakte in 1 ml MeOH, filtern sie durch einen 0,45 & mgr; m Porengröße Filter und führen Hochleistungs-Flüssigkeits – Chromatographie (HPLC) 14. Im Falle von polyketomycin statten das HPLC – System mit einer C18 – Vorsäule (4,6 x 20 mm 2) und einer C18 – Säule (4,6 x 100 mm 2). Verwenden eines linearen Gradienten von Acetonitril + 0,5% Essigsäure im Bereich von 20% bis 95% in H 2 O + 0,5% Essigsäure (Fließgeschwindigkeit: 0,5 ml min -1). HINWEIS: Polyketomycin eine Retentionszeit von 25,9 min hat (siehe Abbildung 1A). Das UV / vis – Spektrum weist Maxima bei 242 nm, 282 nm, 446 nm und Minima bei 262 nm und 359 nm (siehe 1B). Im negativen Modus eine Masse von 863,2 [MH] – nachweisbar ist (siehe Abbildung 1C). "Src =" / files / ftp_upload / 54952 / 54952fig1.jpg "/> Abbildung 1: LC / MS – Analyse von Polyketomycin. (A) HPLC – Chromatogramm (λ = 430 nm) des Rohextraktes nach der Kultivierung von Streptomyces diastatochromogenes Tü6028 für 6 Tage. Polyketomycin hat eine Retentionszeit von 25,9 min (B) UV / Vis – Spektren von Polyketomycin. (C) Die Massenspektren von Polyketomycin im negativen Modus. Hauptgipfel mit m / z 863,2 [MH] -. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen. Bezeichnung des antibiotische Aktivität Hemmhof – Test unter Verwendung von Impfen Teststämme wie Gram-positive Bakterien Bacillus subtilis (in LB – Medium LB 20 g, Leitungswasser 1 l, pH 7,4) und andere Stämme Streptomyces (in TSB – Medium; tryptische Sojabrühe 30 g, Leitungswasser 1 L, pH 7.2), Gram-negativen Bakterien Escherichia coli (in LB – Medium) und Pilzstämmen (in Medien wie YPD Medium; Hefeextrakt 10 g, Pepton 20 g Glucose 20 g Leitungswasser 1 l, pH 7,4). Nehmen Sie 100 ul der Teststamm Vorkultur und verteile sie auf entsprechende Agarplatten. Man löst den Rohextrakt oder gereinigte Verbindung in 500 & mgr; l Methanol (alternativ Wasser oder DMSO) und Pipette 20-50 & mgr; l auf sterile Papierscheiben. Trockene Papierscheiben für 30 min unter der Werkbank und legte sie auf die Platten mit Testkulturen. Bereiten Sie eine Negativkontrolle (Lösungsmittel) und eine positive Kontrolle (Antibiotikum, zB Apramycin [1 mg]). Inkubieren Sie die Platten unter angemessenen Bedingungen, bis die Teststämme sichtbar geworden sind und Hemmzone bestimmen, wenn offensichtlich. Inkubieren E. coli und Bacillus sp. bei 37 ° C für 16 h, Streptomyces sp. bei 28 ° C für 2-4 Tage, Pilzstamm (in erster Linie abhängig von genauen Teststamm) eint 30 ° C für 2 Tage). 2. Large Scale Extraktion, Reinigung und Strukturaufklärung der Verbindung Pflegen S. diastatochromogenes in 5 L HA – Medium (Glucose 4 g, Hefeextrakt 4 g, Malzextrakt 10 g Leitungswasser 1 l, pH 7,2). Beimpfen von 2 ml der Vorkultur in 30 x 500 ml-Erlenmeyerkolben, enthaltend 150 ml HA Medium. Inkubiere die Belastung bei 28 ° C für 6 Tage auf einem Rotationsschüttler bei 180 Upm. Ernten Sie die Zellen durch Zentrifugation (10 min, 15.000 xg, RT) und Extrakt Verbindungen unter Verwendung von Ethylacetat (siehe Abschnitt 1.3). Abbildung 2: Workflow für Strukturaufklärung. Das Verfahren umfasst (1) Kultivierung des Stammes, (2) Extraktion, (3) Reinigung mittels Festphasenextraktion (SPE), Dünnschichtchromatographie (TLC), präparative Hochleistungs-Flüssigchromatographie (HPLC), sizeexclusion chromatography (SEC) und (4) Strukturaufklärung durch Massenanalyse (MS), kernmagnetische Resonanz (NMR) und Röntgenmessungen. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen. Reinigung von Polyketomycin HINWEIS: Der Prozess der Reinigung und Strukturaufklärung ist in Abbildung 2 dargestellt. Fraktionieren Rohextrakt durch eine C18 – Festphasenextraktion (SPE) Säule mit einem 10% -stepwise MeOH – Gradienten im Bereich von 30% bis 100% MeOH in H 2 O, 100 ml für jede Bedingung. Reinige die Verbindung enthaltende Fraktion weiter durch präparative Dünnschichtchromatographie (TLC) unter Verwendung von 15 CH 2 Cl 2 / MeOH (7: 1) als Elutionssystem. Reinige die Verbindung durch präparative HPLC 16. Statten das HPLC-System mit einer C18-Vorsäule (5 & mgr; m, 9,4 x 20 mm) und eineHauptsäule (5 & mgr; m, 9,4 x 150 mm). Verwenden eines Gradienten von Acetonitril + 0,5% Essigsäure im Bereich von 20% bis 95% in H 2 O + 0,5% Essigsäure (Fließgeschwindigkeit: 2,0 ml / min). Lösemittel- und andere kleine Verunreinigungen zu entfernen, führen einen letzten Reinigungsschritt durch Grßenausschlußchromatographie unter Verwendung einer Säule in MeOH 17. Sammeln Sie die letzte reine Verbindung und verdunsten MeOH durch Rotationsverdampfung bei 40 ° C und 240 bar. Strukturaufklärung Man löst die reine Verbindung (mehr als 2 mg) in 600 bis 700 & mgr; l (abhängig von der Maschine) von DMSO – d 6, Rekord 1D – NMR (1 H, 13 C) und 2D – NMR (HSQC, HMBC, 1 H- 1 H COSY – Spektren) auf einem NMR – Spektrometer 18 auf . Express – chemischen Verschiebungen in δ – Werten (ppm) unter Verwendung von DMSO – d 6. Nehmen Sie ein hochauflösendes Massenspektrum (HRESI-MS) 19 von polyketomycin ein hochauflösendes mitMassenspektrometer. Erläutern die Struktur , die durch die Interpretation der Ergebnisse der NMR- und MS – Datenanalyse 10. 3. Einen Biosynthetisches Modell der neuen isolierten Verbindung Analysieren der Struktur der isolierten Verbindung und vorherzusagen, Enzyme, die in ihrer Biosynthese beteiligt sein könnten. Ordnen sie Polyketid (Typ I, II oder III), nicht-ribosomale Peptidsynthese, lantipeptide, Terpenoid oder Zucker Stoffwechselweg 8. Beispiel polyketomycin Subdivide die Struktur in der Hand einzelne Einheiten: tetracyclic Einheit, zwei Mono- und Dimethyl-Salicylsäure. Herauszufinden, wo die Reste könnten abgeleitet werden: Die tetracyclischen Rest kann aus einer Polyketidsynthase vom Typ II sowie die Dimethyl- Salicylsäure-Einheit abgeleitet werden kann durch eine iterative Polyketidsynthase Typ I. Die beiden Zuckereinheiten abgeleitet werden, die 6-Desoxyzucker sind könnte, werden SYNTHESIzed von Glucose eine TDP-Glucose-4,6-Dehydratase während der Biosynthese und befestigt wahrscheinlich durch zwei Glycosyltransferasen beteiligt (siehe Abbildung 3) 8. Vorherzusagen putative Genen im Cluster. Denken Sie an Enzymen, die bei der Synthese der einzelnen Einheiten beteiligt sind, die Einheiten bei der Verbindung sowie bei der Modifizierung und das Molekül zuzuschneiden. Das Gencluster von Polyketomycin höchstwahrscheinlich enthält Gene , die für eine Polyketid – Synthase Typ II (also mindestens ein ACP, KS α und KS β für Verlängerungseinheiten verbindet), ein iterativer Polyketidsynthase- Typ I (mindestens ACP, AT, KS), ein TDP-Glucose-4,6-Dehydratase (notwendig für Schritt: Glucose → Desoxyglucose) und zwei Glycosyltransferasen (Anbringen von zwei Zucker Monomeren dem Aglykon) 8. Figur 3: Struktur der Polyketomycin Divided in Einzelbausteine. Polyketomycin besteht aus einem tetracyclischen decaketid (PKS vom Typ II) und einer dimethyl Salicylsäure (iterative PKS vom Typ I), verbunden durch die beiden Desoxyzucker Einheiten β-D-amicetose und α-L-axenose (NDP-Glucose-4,6- Dehydratase und zwei Glycosyltransferase erforderlich). Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen. 4. Genome Sequencing / Bergbau Next Generation Sequencing Sequenz , die die genomische DNA durch Sequenzierung der nächsten Generation Technologien wie Illumina, 454 Pyrosequenzierung oder SOLiD 20. Richten Sie einzelne liest zu einer Referenzsequenz oder montieren de novo. HINWEIS: Das Genom von S. diastatochromogenes Tü6028 am Zentrum für Biotechnologie (CeBiTec) an der Universität Bielefeld wurde sequenziert. Alle liest wurden zu einem Entwurf Genom zusammengesetztvon 7,9 Mb. Genome Mining Suche nach offenen Leserahmen (ORFs) durch die Verwendung von beispielsweise NCBI Prokaryotic Genomannotation Pipeline 21,22, RAST (schnelle Annotation mit Subsystem – Technologie) 23,24,25, Prokka (Rapid prokaryotischen Genomannotation) 26 oder GenDB 27. Diese Programme schlagen auch ihre Funktionen. Die Analyse des S. diastatochromogenes Tü6028 Entwurf Genoms zur Identifizierung von mehr als 7.000 ORFs führte Sequenz. Führen Sie bestimmte BLAST (Basic Local Alignment Search Tool) Analyse weitere Informationen wie Ausrichtungen mit anderen ähnlichen Genen und katalytischen Domänen 28,29,30 zu erhalten. Zur Identifizierung des sekundären Metaboliten-Gencluster laufen Programme wie antiSMASH 31,32,33, NaPDoS 34 und NRPSpredictor 35,36. Im Entwurf Genom von Streptomyces diastatochromogenes antiSMASH 31,32,33 Identiziert 22 Gencluster. Analysieren die putative Gencluster für ihre enzymatischen Weg (s) (Polyketidsynthase (Typ I, II oder III), nicht-ribosomale Peptidsynthetase, lanthipeptide, Terpenoid, Zuckerstoffwechsel, …). Suchen Sie nach Cluster (n), die Gene, die bei der Synthese der Verbindung beteiligt sein könnten (siehe Abschnitt 3). In S. diastatochromogenes annotierten Cluster 2 enthält Typ Polyketidsynthase II – Gene, drei Polyketidsynthase Typ – I – Gene, ein TDP-Glucose-4,6-Dehydratase Gen und zwei Glycosyltransferase – Gene (siehe Abbildung 4). Konzentrieren sich auf einzelne Gene innerhalb des Clusters. Für PKS vom Typ I und NRPS die Spezifität der Acyltransferasen und Adenylierungsdomänen und damit den Einbau von Einzelverlängerungseinheiten können vorhergesagt werden. Vergleichen Sie auch die Reihenfolge der eingebauten Erweiterungseinheit mit dem Molekül. antiSMASH 31,32,33 zeigt auch ähnliche Cluster von bereits bekannten Verbindungen, mit einem Link zu MIBiG Datenbank 37. </li> Vergleichen Sie die Struktur der Verbindung mit diesen anderen Verbindungen und prüfen, ob Ähnlichkeiten. Abbildung 4: antiSMASH Ausgabe von Polyketomycin Biosynthesegenclusters und Übersicht von anderen Clustern in S. diastatochromogenes Tü6028. (A) Übersicht über die vorhergesagte Biosynthesegencluster in das Genom von S. diastatochromogenes Tü6028; (B) Cluster 2 Polyketomycin Biosynthesegenclusters mit gezielten Gene. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen. 5. Prüfung des Biosynthesegenclusters Suchen Sie nach einem Gen mit der Hand und wichtig (essentielle) Funktionen für die Biosynthese der Verbindung. Zur Überprüfung der polyketomycin Gencluster das Gen pokPI, kodiert für die Ketosynthase- α von der PKS vom Typ II, wurde durch eine aus dem Rahmen -deletion (siehe 5B) ausgewählt und inaktiviert. Alternativ unterbrechen das Gen durch ein internes Fragment Klonen (siehe 5C). Abbildung 5: Überprüfung eines Gen – Cluster von Einzel Crossover. (A) natives Gen führt zur Übersetzung eines funktionellen Proteins; (B) Klonierung des Gens mit interner Deletion in einem Suizidvektor führt zu einem einzigen Crossover was zu einer Rahmenverschiebung in dem Zielgen und anschließende Translation von nicht-funktionellen Proteins; (C) Klonierung eines internen Fragments des Gens in einem Suizidvektor führt zu einer Verkürzung des Gens und anschließende Translation eines nicht-funktionellen Proteins. oriT: Ursprung von transfer; Antibiotikum R: Antibiotika – Resistenz. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen. Klonierung des Single-Crossover – Konstrukt Amplify ein Fragment pokPI durch PCR 38 mit Primern pokPI_for und pokPI_rev enthält. Clone PCR – Produkts in Suizidvektor pKC1132 39 (Apramycin R [50 mg / mL]). Der Suizid – Vektor nicht in der Lage in dem Streptomyces – Stamm zu replizieren und somit in das Zielgen durch homologe Rekombination zu integrieren Apramycin-Widerstand bereitzustellen. Übertragen des Vektors in E. coli Klonen Wirt durch Hitzeschock Transformation 40. Isolieren Sie den Vektor durch alkalische Lyse 41. Digest die Vektor-DNA mit einem einzigen Messerrestriktionsenzym, das innerhalb des Fragments schneidet. Die pokPI gene wurde verdaut mit Enzym KpnI Behandle verdauten Vektor DNA mit großer DNA-Polymerase I (Klenow) -Fragment, das 5 weist '→ 3'-Polymerase-Aktivität und 3' → 5'-Exonuklease-Aktivität. Abstumpfung der klebrigen Enden und anschließende Religation führt zum Verlust von vier Basen. Prüfen , für den Verlust dieser Basen durch die Schritte der Transformation in E. coli XL1 Blue, einzelne Kolonien Kommissionieren, Isolieren ihrer Plasmid DNA, 41 und die Analyse weiter durch Restriktionsverdau und Sequenzierung. Die Konjugation des Single-Crossover – Konstrukt in Streptomyces Übertragen Sie den Suizidvektor der pokPI Gen (pKC1132_ pokPI del) mit einer Deletion in E. coli ET12567 pUZ8002 42 (Kanamycin R) durch Hitzeschock Transformation 40 enthält. Inkubieren Sie die Zellen in 100 ml LB – Medium (Kanamycin 50 ug mL -1, Apramycin 50 ug mL -1 </sup>) Über Nacht bei 37 ° C. Ernte die Zellen durch Zentrifugation (3000 xg, 10 min, 4 ° C) und wäscht die Zellen zweimal durch Resuspendieren in 50 ml LB-Medien. Schließlich Resuspendiere Zellen in 2 x 500 ul LB-Medien. Mischen Sie 500 ul E. coli pUZ8002 pKC1132_ pokPI del mit 500 & mgr; l Streptomyces diastatochromogenes Kultur (alternativ Sporen verwenden). Verbreiten Sie die Mischung auf MS – Platten (Sojamehl 20 g, D-Mannit 20 g, MgCl 2 10 mM, Agar 1,5%, Wasser 1 L tippen). Inkubieren der Platten für 20 h bei 28 ° C. Overlay jede Platte mit Apramycin (1,25 mg) und Fosfomycin (5 mg) in 1 ml Wasser gelöst und trocknen lassen. Inkubieren der Platten für mehrere Tage bei 28 ° C bis Exkonjuganten sichtbar sind. Überprüfen Sie Single-Crossover – Mutanten Impfen einzelne Exconjuganten in 20 ml TSB – Medium (Apramycin 50 mg mL -1) und inkubieren bei 28 ° C für drei Tage und 180 Umdrehungen pro Minute. Isolieren Sie genomische DNA 43 und überprüfen Unterbrechung des pokPI – Gens durch PCR. Impfen einzelne Klone mit verifizierten Gen Unterbrechung und Streptomyces Wildtypstamm in 100 ml HA Medium und Inkubation sie für 6 Tage bei 28 ° C und 180 Umdrehungen pro Minute. Extrahieren Sie den Rohextrakt (siehe Abschnitt 1.3). Überprüfen Sie Verbindung Produktion von HPLC-MS-Analyse (siehe Abschnitt 1.4). Der entsprechende Peak im HPLC – Chromatogramm und die Masse der Verbindung nicht nachweisbar sein sollten nicht mehr (siehe Abbildung 6). Abbildung 6: HPLC – Analyse von S. diastatochromogenes mit inaktivierten pokPI Gene. HPLC – Chromatogramm (λ = 430 nm) Rohextrakt von S. diastatochromogenes WT (oben) und mutierten Stamm mit unterbrochen pokPI -Gen (unten). Der Mutantenstamm produziert nicht mehr polyketomycin.Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.