من المنتج الطبيعي إلى Its العنقودية السكروز جين: تظاهرة طريق Polyketomycin من<em> السبحية diastatochromogenes</em> Tü6028
Summary
هنا نقدم بروتوكول مفصلة من (أ) تحديد نتاج طبيعي مع النشاط المضاد الحيوي، (ب) تطهير المجمع (C) النموذج الأول من الحيوي لها، (D) تسلسل الجينوم / -mining و( E) التحقق من الكتلة التخليق الحيوى الجينات.
Abstract
ومن المعروف أن سلالات السبحية لقدرتها على إنتاج الكثير من مركبات مختلفة مع مختلف bioactivities. زراعة في ظل ظروف مختلفة وغالبا ما يؤدي إلى إنتاج مركبات جديدة. لذلك، يتم استخراج الثقافات إنتاج سلالات مع خلات الإيثيل ويتم تحليل المستخلصات الخام بواسطة HPLC. وعلاوة على ذلك، يتم اختبار مقتطفات عن النشاط الحيوي من خلال فحوصات مختلفة. لبنية توضيح وتنقية مجمع الفائدة عن طريق مزيج من أساليب اللوني مختلفة.
تسلسل الجينوم جانب التعدين الجينوم يسمح بتحديد مجموعة المنتجات الطبيعية التخليق الحيوى الجينات باستخدام برامج الكمبيوتر المختلفة. لتأكيد أن تم التعرف على مجموعة الجينات الصحيحة، والتجارب تثبيط الجين يجب أن تؤديها. ويتم تحليل المسوخ الناتجة عن إنتاج منتج طبيعي معين. مرة واحدة وقد تم المعطل الكتلة الجينات الصحيحة،يجب أن تفشل سلالة لإنتاج مركب.
يظهر العمل للpolyketomycin مركب مضاد للجراثيم التي تنتجها السبحية diastatochromogenes Tü6028. منذ حوالي عشر سنوات، عندما كان تسلسل الجينوم لا تزال مكلفة للغاية، وكان الاستنساخ وتحديد مجموعة الجينات عملية تستغرق وقتا طويلا جدا. سريع تسلسل الجينوم جنبا إلى جنب مع التعدين الجينوم يسرع محاكمة تحديد العنقودية ويفتح طرق جديدة لاستكشاف الحيوي وتوليد المنتجات الطبيعية رواية بالطرق الوراثية. بروتوكول وصفها في هذه الورقة يمكن أن تسند إلى أي مركب آخر المستمدة من سلالة السبحية أو الكائنات الحية الدقيقة آخر.
Introduction
وكانت منتجات الطبيعية من النباتات والكائنات الحية الدقيقة دائما مصدرا هاما لتطوير العقاقير السريرية والبحوث. تم اكتشاف أول البنسلين المضادات الحيوية في عام 1928 من فطر بواسطة الكسندر فليمنغ 1. في الوقت الحاضر، وتستخدم العديد من منتجات طبيعية أكثر في العلاج السريري.
واحد جنس المعروف عن قدرته على إنتاج أنواع مختلفة من المركبات الثانوية مع bioactivities المختلفة هو السبحية. السبحية هي إيجابية الجرام البكتيريا وتنتمي إلى فئة من شعاويات والنظام الشعاوات. وتستمد ما يقرب من ثلثي من المضادات الحيوية المستخدمة سريريا من الشعاوات، ومعظمهم من السبحية، مثل أمفوتيريسين 2، daptomycin 3 أو التتراسيكلين (4). وقد تم منح جائزتي نوبل في مجال السبحية البحوث المضادات الحيوية. ذهب أول من سلمان واكسمان لاكتشاف الستبرتوميسين، وعلى الأولtibiotic فعالة ضد مرض السل. 5 في عام 2015، كجزء من جائزة نوبل في علم وظائف الأعضاء والطب، وحصل على اكتشاف أفيرميكتين من avermitilis S. كذلك. يستخدم أفيرميكتين لعلاج الأمراض الطفيلية 6،7.
النهج التقليدي لاكتشاف المنتجات الطبيعية في الكائنات الحية الدقيقة مثل السبحية ينطوي عموما زراعة سلالة في ظل ظروف النمو المختلفة، وكذلك استخراج وتحليل المركبات الثانوية. يتم إجراء فحوصات النشاط الحيوي (على سبيل المثال فحوصات للنشاط مضاد للبكتيريا ومضاد للسرطان) للكشف عن نشاط المجمع. وأخيرا، يتم عزل مجمع الفائدة وإجمال التركيب الكيميائي.
وغالبا ما تتكون هياكل المنتجات الطبيعية من الأنصاف واحدة والتي تشكل الجزيئات المعقدة. وهناك عدد قليل، ولكن محدودة، مسارات السكروز الرئيسية المؤدية إلى بناء كتلةكانساس، والتي تستخدم لالحيوي من المنتجات الطبيعية. مسارات السكروز الرئيسية هي مسارات متعدد الكيتيد والممرات المؤدية إلى تيربينويدس وقلويدات والممرات باستخدام الأحماض الأمينية، والممرات المؤدية إلى الأنصاف السكر. ويتميز كل مسار من قبل مجموعة من إنزيمات معينة (8). وبناء على هيكل المركبة، هذه الإنزيمات السكروز يمكن التنبؤ بها.
في الوقت الحاضر، فإن التحليل الهيكلي التفصيلي للمجمع في تركيبة مع تسلسل الجيل القادم وتحليل بيوينفورمتيك يمكن أن تساعد على تحديد الكتلة الجين السكروز المسؤولة. يفتح المعلومات العنقودية طرقا جديدة لإجراء مزيد من البحوث المنتجات الطبيعية. وهذا يشمل تعبير مغايرة لزيادة الغلة من المنتجات الطبيعية، وتعديل المجمع الذي استهدفته الغارة بالحذف الجينات أو التعديل والحيوي اندماجي مع جينات من المسارات الأخرى.
تم عزل Polyketomycin بشكل مستقل من مرق ثقافةسلالتين، السبحية ليرة سورية. MK277-AF1 9 و السبحية diastatochromogenes Tü6028 10. تم توضيح الهيكل من خلال تحليل الرنين المغناطيسي والأشعة السينية. يتكون Polyketomycin من decaketid tetracyclic وحمض الصفصاف ثنائي ميثيل، وترتبط من قبل اثنين من الأنصاف deoxysugar β-D-amicetose وα-L-axenose. فإنه يعرض السامة للخلايا ونشاط المضادات الحيوية، حتى ضد سلالات البكتيريا إيجابية الغرام المقاوم للأدوية المتعددة مثل هذه الجرثومة 11.
تم إنشاء مكتبة كوزميد الجينومية س diastatochromogenes Tü6028 وفحص منذ سنوات عديدة. باستخدام جين معين تحقيقات الكتلة الجين polyketomycin بحجم 52.2 كيلوبايت، التي تحتوي على 41 الجينات، وتبين بعد عدة أشهر من العمل المكثف 12. مؤخرا، تم الحصول على تسلسل مشروع جينوم diastatochromogenes س تؤدي إلى تحديد سريع من الكتلة الجين السكروز polyketomycin. في هذا الاستعراض، وهي طريقة تساعد في الاتساعمنظمة حددت منتج طبيعي وتوضيح وسوف نتناول مجموعة الجين السكروز، وذلك باستخدام polyketomycin كمثال على ذلك.
نحن هنا شرح الخطوات واحدة والتي تؤدي من نتاج طبيعي لمجموعة لها الجين السكروز تعرض لpolyketomycin التي تنتجها السبحية diastatochromogenes Tü6028. ويضم بروتوكول تحديد وتنقية نتاج طبيعي مع خصائص المضادات الحيوية. التحليل البنيوي أخرى، ومقارنة مع النتائج من الجينوم التعدين تؤدي إلى تحديد مجموعة الجينات السكروز. ويمكن تطبيق هذا الإجراء على أي مركبة أخرى مستمدة من سلالة السبحية أو أي الكائنات الحية الدقيقة الأخرى.
Protocol
Representative Results
Discussion
في هذا المختبر تم إنشاء مكتبة كوزميد الجينومية من diastatochromogenes السبحية وفحص قبل سنوات عديدة، مما أدى إلى تحديد الكتلة polyketomycin الجينات من خلال عملية للغاية تستغرق وقتا طويلا. كان توصيف جينات مفردة من الممكن استخدام الحذف الجينات المستهدفة وتحليل المسوخ الناتج 12. مؤخرا، تم الحصول على تسلسل مشروع جينوم diastatochromogenes S. السماح تحديد سريع من الكتلة الجين السكروز polyketomycin. نحن يمكن بسهولة اكتشاف جينات السكروز، على الرغم من أن تسلسل مشروع الجينوم يحتوي يزال العديد من contigs. عملية وصفها لا يمكن أن يتحقق في غضون أشهر. ومع ذلك، يشتمل الإجراء العديد من الخطوات. قد تفشل الخطوات واحدة عدة مرات، ومنع التقدم إلى الخطوات اللاحقة:
ومن المعروف أن جنس السبحية لقدرتها على إنتاج المركبات الحيوية النشطة. في حين أنها تحمل في كثير من الأحيان أكثر من 20 السيرمجموعات الجينات ynthetic، وعادة ما يتم إنتاج مركبات احد أو اثنين فقط تحت ظروف المختبر. تطبيق نهج OSMAC (زراعة سلالة واحدة في ظل ظروف مختلفة) أن يستيقظ مجموعات الجينات الصامتة أحيانا قد لا يكون كافيا. التلاعب الجيني للجينات التنظيمية، مثل الجينات منظم عديد المظاهر adpA 44 و bldA 45،46، هو أيضا وسيلة فعالة لتنشيط إنتاج المركبات الثانوية الأخرى.
للتوضيح لهيكل المجمع، مثلا عن طريق تحليل الرنين المغناطيسي، عادة ما تكون أكثر من 2 ملغ من مجمع تنقية ضروري. لذلك، غالبا ما يتطلب تخمر الثقافة أكثر من 10 لتر. بدون تخمير قادرة على الحفاظ على الأكسجين، ودرجة الحموضة ودرجة الحرارة الظروف، قد يكون تحديا في مختبر صغير للتعامل مع هذا القدر من الثقافة واستخراج لاحق. خلال تنقية، قد يتم تغيير المجمع بسبب الأكسدة والإشعاع أو درجة الحرارة.أيضا، يتم استخدام مزيد من الخطوات لتنقية، وارتفاع فرصة للتدهور.
عند تحليل هيكل المنتجات الطبيعية، ومجموعات في الجينوم، وأحيانا ليس من السهل تحديد الكتلة المناسبة. أولا، إذا كان هناك ليست سوى سلسلة مشروع الجينوم جزء من الكتلة قد يكون في عداد المفقودين. ثانيا، ليست كل الجينات التي مطلوبة من أجل الحيوي هي في الكتلة. ثالثا، وأحيانا يتم تقسيم مجموعة إلى قسمين فصلها عن بعضها البعض من خلال العديد من kilobases. رابعا، قد يكون من الصعب تحديد واحد الذي هو الكتلة الجينات المناسبة. في حالة كبيرة نوع PKS أنا أو أنظمة NRPS، حيث أنه من الممكن لحساب عدد الوحدات الموسع استنادا إلى عدد من وحدات، أو حتى تحديد وحدات الموسع واحدة من خلال تحليل المجالات اختيار، فإنه يتحول بسهولة. ومع ذلك، في حالة العمل بشكل متكرر الانزيمات التنبؤ من المركبات توليفها في كثير من الأحيان غير ممكن، وخاصة إذا كان سترافي أكثر من 40 مجموعات الجينات. خامسا، والطبيعة هي معقدة للغاية ومليئة المركبات غير معروف حتى الآن. في كثير من الأحيان الحيوي هو خليط من مسارات مختلفة. إذا لم يتم تحديد المركب الجديد بعد، أو لا علاقة لمركب آخر، قد يكون من الصعب تحديد الكتلة، إلى اقتراح نموذج الحيوي ولاثبات ذلك.
بعد أن يتم تحديد الكتلة، وتقنية كروس واحد هو وسيلة جيدة وسريعة للتحقق من فرضية. PCR، استنساخ في ناقلات الانتحار، الاقتران، واختيار من الحيوانات المستنسخة إيجابية، وفحص الانتاج هي الخطوات المطلوبة فقط. عيب واحد من هذه التقنية هو أن التكامل بين ناقلات في كروموسوم غير مستقر بسبب المزيد من الأحداث إعادة التركيب. ولذلك، من أجل مواصلة تحليل الجينات واحدة، يطلب حذف الجينات دقيقة. كما أنها قد تكون صعبة للتلاعب سلالات السبحية على المستوى الجيني.
الإجراء الموضح يمكن تعيين رس أي مركبة أخرى تنتجها سلالة السبحية أو الكائنات الحية الدقيقة آخر. المعرفة حول مجموعة الجين السكروز ومجمعها توليفها يعطينا مزيدا من الفرص لتعديل بالفعل الجزيئات الموجودة بهدف تحسينها لمكافحة الجراثيم المقاومة للأدوية المتعددة.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
S. Zhang is funded by China Scholarship Council. The authors are very grateful to former people working on polyketomycin project in this lab and Prof. Dr. Hans-Peter Fiedler, University of Tübingen, for providing the polyketomycin producer. The research was supported by the DFG (RTG 1976).
Materials
| agar | Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Germany | 5210.4 | |
| agarose | Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Germany | 6352.4 | |
| D-mannitol | Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Germany | 4175.1 | |
| glucose | Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Germany | 6780.1 | |
| LB | Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Germany | X964.3 | |
| malt extract | Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Germany | X976.2 | |
| MgCl2 | Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Germany | 2189.1 | |
| Peptone | Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Germany | ||
| soy flour | W.Schoenemberger GmbH, Magstadt, Germany | Hensec-Vollsoja | |
| tryptic soy broth | Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Germany | X938.3 | Caso-Bouillon |
| yeast extract | Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Germany | 2363.2 | |
| Solvents | |||
| Acetic acid | Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Germany | 3738.5 | |
| Acetone | Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Germany | 9372.2 | |
| Acetonitrile | Avantor Performance Materials B.V., Deventer, The Netherlands | JT-9012-03 | |
| Dichlorofrom | Fisher Scientific GmbH, Schwerte, Germany | 1530754 | |
| DMSO (Dimethyl sulfoxide) | Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Germany | 4720.1 | |
| DMSO-d6 (Dimethyl sulfoxide-d6) 99.9atom%D | ARMAR Chemicals, Döttingen, Switzerland | 15200.204 | |
| Ethyl acetate | Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Germany | 6784.4 | |
| Hydrochloric acid | Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Germany | 6331.4 | |
| Methanol | Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Germany | 7342.1 | |
| Enzymes | |||
| restriction enzymes | New England Biolabs GmbH, Frankfurt am Main, Germany | ||
| polymerase | New England Biolabs GmbH, Frankfurt am Main, Germany | ||
| DNA Polymerase I Large (Klenow) Fragment | Promega GmbH, Mannheim, Germany | ||
| Antibiotics | |||
| apramycin | AppliChem GmbH, Darmstadt, Germany | A7682.0005 | |
| fosfomycin | Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, Germany | P5396-50G | |
| kanamycin | Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Germany | T832.2 | |
| Plasmid/Vectors | |||
| pKC1132 | Bierman et al. 1992 | ||
| Primer | |||
| pokPI_for | TGATGGTGCCGCTGGCCATGG | Primer to amplify fragment containing pokPI gene | |
| pokPI_rev | AGCGTTCACTGTTCCGCCCGAC | ||
| Bacterial strains | |||
| Bacillus subtilis COHN ATCC6051 | Gram-positive test strain | ||
| Escherichia coli ET12567 pUZ8002 | MacNeil et al., 1992 | strain for conjugation | |
| Escherichia coli XL1 Blue | Agilient Technologies, Santa Clara, USA | Gram-negative test strain + cloning host | |
| Streptomyces diastatochromogenes Tü6028 | Paululat et al., 1999 | Polyketomycin producer | |
| Online services | |||
| antismash (Antibiotics and Secondary Metabolite Analysis Shell) | http://antismash.secondarymetabolites.org/ | Detection of secondary metabolite gene cluster | |
| BLAST (Basic Local Alignment Search Tool) | http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi | finds regions of similarity between biological sequences | |
| GenDB | https://www.uni-giessen.de/fbz/fb08/Inst/bioinformatik/software/gendb | Annotation of ORFs | |
| MiBIG (Minimum Information about a Biosynthetic Gene cluster) | http://mibig.secondarymetabolites.org/ | Database of biosyntetic gene clusters | |
| NaPDoS | http://napdos.ucsd.edu/ | Detection of seconary metabolite gene cluster | |
| NCBI Prokaryotic Genome Annotation Pipeline | http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/annotation_prok/ | Annotation of ORFs | |
| NRPSpredictor | http://nrps.informatik.uni-tuebingen.de/ | Detection of NRPS domains | |
| Prokka (rapid prokaryotic genome annotation) | http://www.vicbioinformatics.com/software.prokka.shtml | Annotation of ORFs | |
| RAST (rapid annotation using subsystems technology) | http://rast.nmpdr.org/ | Annotation of ORFs | |
| other programs | |||
| Chem Station Rev. A.09.03 | Agilent Technologies, Waldbronn, Germany | Handling program for HPLC | |
| Clone Manager Suite 7 | Scientific and Educational Software, Cary, USA | Designing Cloning Experiment | |
| Newbler v2.8 | Roche Diagnostics | Alignment of sequencing reads | |
| Machines | |||
| Centrifuge Avanti J-6000, Rotor JA-10 | Beckman Coulter GmbH, Krefeld, Germany | ||
| HPLC/MS | Agilent Technologies, Waldbronn, Germany | ||
| _Autosampler: G1313A | Agilent Technologies, Waldbronn, Germany | ||
| _Pre-column: XBridge C18 (20 mm x 4.6 mm; Particle size: 3.5 µm) | Agilent Technologies, Waldbronn, Germany | ||
| _Column:Xbridge C18 (100 mm × 4.6 mm; Particle size: 3.5 μm) | Agilent Technologies, Waldbronn, Germany | ||
| _semi-prep Pre-Column: Zorbax B-C18 (9.4 x 150 mm; Particle size: 5 µm) | Agilent Technologies, Waldbronn, Germany | ||
| _semi-prep Column: Zorbax B-C18 (9.4 x 20 mm; Particle size: 5 µm) | Agilent Technologies, Waldbronn, Germany | ||
| _Degasser: G1322A | Agilent Technologies, Waldbronn, Germany | ||
| _Quarternary pump: G1311A | Agilent Technologies, Waldbronn, Germany | ||
| _Diode array detector (DAD )G1315B (λ = 254 nm and 400 nm) | Agilent Technologies, Waldbronn, Germany | ||
| _Quadrupole mass detector (MSD) G1946D(2-3000 m/z) | Agilent Technologies, Waldbronn, Germany | ||
| rotary evaporator | |||
| _heating bath Hei-VAP Value/G3 | Heidolph Instruments GmbH & Co.KG, Schwabach, Germany | ||
| _vacuum pump system SC 920 G | KNF Global Strategies AG, Sursee, Switzerland | ||
| other material | |||
| Sephadex LH20 | GE Healthcare, | ||
| Chromafil PVDF-45/15MS (pore size 0.45 µm; filter Ø15 mm) | MACHEREY-NAGEL GmbH & Co. KG, Düren, Germany | ||
| SPE column Oasis HLB 20 35 cc (6g) | Waters GmbH, Eschborn, Germany | ||
| E. coli | Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Germany | Medium: LB, Composition: LB, Amount to 1 L H2O: 20 g | |
| Bacillus | Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Germany | Medium: LB, Composition: LB, Amount to 1 L H2O: 20 g | |
| Streptomyces sp. | Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Germany | Medium: TSB, Composition: CASO Boullion, Amount to 1 L H2O: 30 g | |
| fungus | Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Germany | Medium: YPD, Composition: Yeast extract, Amount to 1 L H2O: 10 g | |
| fungus | Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Germany | Medium: YPD, Composition: Peptone, Amount to 1 L H2O: 20 g | |
| fungus | Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Germany | Medium: YPD, Composition: Glucose, Amount to 1 L H2O: 20 g | |
| for agar plates add 2 % agar | |||
References
- Fleming, A. On the antibacterial action of cultures of a penicillin, with special reference to their use in isolation of B. influenzae. Br J Exp Pathol. 10 (3), 226-236 (1929).
- Lemke, A., Kiderlen, A. F., Kayser, O. Amphotericin B. Appl. Microbiol. Biotechnol. 68 (2), 151-162 (2005).
- Kirkpatrick, P., Raja, A., LaBonte, J., Lebbos, J. Daptomycin. Nat. Rev. Drug Discov. 2 (12), 943-944 (2003).
- Zakeri, B., Wright, G. D. Chemical biology of tetracycline antibiotics. Biochem. cell Biol. 86 (2), 124-136 (2008).
- Schatz, A., Bugle, E., Waksman, S. A. Streptomycin, a Substance Exhibiting Antibiotic Activity Against Gram-Positive and Gram-Negative Bacteria. Exp. Biol. Med. 55 (1), 66-69 (1944).
- Burg, R. W., et al. Avermectins, new family of potent anthelmintic agents: producing organism and fermentation. Antimicrob. Agents Chemother. 15 (3), 361-367 (1979).
- Egerton, J. R., Ostlind, D. A., et al. Avermectins, new family of potent anthelmintic agents: efficacy of the B1a component. Antimicrob. Agents Chemother. 15 (3), 372-378 (1979).
- Walsh, C. T., Fischbach, M. A. Natural products version 2.0: connecting genes to molecules. J. Am. Chem. Soc. 132 (8), 2469-2493 (2010).
- Momose, I., et al. Polyketomycin, a new antibiotic from Streptomyces sp. MK277-AF1. II. Structure determination. J. Antibiot. (Tokyo). 51 (1), 26-32 (1998).
- Paululat, T., Zeeck, A., Gutterer, J. M., Fiedler, H. P. Biosynthesis of polyketomycin produced by Streptomyces diastatochromogenes.Tü6028. J. Antibiot. (Tokyo). 52 (2), 96-101 (1999).
- Momose, I., et al. Polyketomycin, a new antibiotic from Streptomyces. sp. MK277-AF1. I. Taxonomy, production, isolation, physico-chemical properties and biological activities. J. Antibiot. (Tokyo). 51 (1), 21-25 (1998).
- Daum, M., et al. Organisation of the biosynthetic gene cluster and tailoring enzymes in the biosynthesis of the tetracyclic quinone glycoside antibiotic polyketomycin. Chembiochem. 10 (6), 1073-1083 (2009).
- Bode, H. B., Bethe, B., Höfs, R., Zeeck, A. Big effects from small changes: possible ways to explore nature’s chemical diversity. Chembiochem. 3 (7), 619-627 (2002).
- Wolfender, J. -. L. HPLC in Natural Product Analysis: The Detection Issue. Planta Med. 75 (07), 719-734 (2009).
- Stahl, E. . Thin-layer chromatography. A laboratory handbook. , (1967).
- Snyder, L. R., Kirkland, J. J., Glajch, J. L. Preparative HPLC Separation. Pract. HPLC Method Dev. , 616-642 (2012).
- Granath, K. A., Kvist, B. E. Molecular weight distribution analysis by gel chromatography on sephadex. J. Chromatogr. A. 28, 69-81 (1967).
- Jackman, L. M., Sternhell, S. Application of Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy in Organic Chemistry. Int. Ser. Org. Chem. , (1969).
- Xian, F., Hendrickson, C. L., Marshall, A. G. High resolution mass spectrometry. Anal. Chem. 84 (2), 708-719 (2012).
- Metzker, M. L. Sequencing technologies – the next generation. Nat. Rev. Genet. 11 (1), 31-46 (2010).
- Tatusova, T., et al. Prokaryotic Genome Annotation Pipeline. NCBI Handb. 2nd Ed. , (2013).
- Angiuoli, S. V., et al. Toward an online repository of Standard Operating Procedures (SOPs) for (meta)genomic annotation. OMICS. 12 (2), 137-141 (2008).
- Aziz, R. K., et al. The RAST Server: rapid annotations using subsystems technology. BMC Genomics. 9, 75 (2008).
- Overbeek, R., et al. The SEED and the Rapid Annotation of microbial genomes using Subsystems Technology (RAST). Nucleic Acids Res. 42, 206-214 (2014).
- Brettin, T., et al. RASTtk: a modular and extensible implementation of the RAST algorithm for building custom annotation pipelines and annotating batches of genomes. Sci. Rep. 5, 8365 (2015).
- Seemann, T. Prokka: rapid prokaryotic genome annotation. Bioinformatics. 30 (14), 2068-2069 (2014).
- Meyer, F. GenDB–an open source genome annotation system for prokaryote genomes. Nucleic Acids Res. 31 (8), 2187-2195 (2003).
- Altschul, S. F., Gish, W., Miller, W., Myers, E. W., Lipman, D. J. Basic local alignment search tool. J. Mol. Biol. 215 (3), 403-410 (1990).
- Madden, T. The BLAST Sequence Analysis Tool. NCBI Handb. 2nd Ed. , (2003).
- Marchler-Bauer, A., et al. CDD: NCBI’s conserved domain database. Nucleic Acids Res. 43, 222-226 (2014).
- Medema, M. H., et al. antiSMASH: rapid identification, annotation and analysis of secondary metabolite biosynthesis gene clusters in bacterial and fungal genome sequences. Nucleic Acids Res. 39, 339-346 (2011).
- Blin, K., et al. antiSMASH 2.0–a versatile platform for genome mining of secondary metabolite producers. Nucleic Acids Res. 41, 204-212 (2013).
- Weber, T., et al. antiSMASH 3.0 – a comprehensive resource for the genome mining of biosynthetic gene clusters. Nucleic Acids Res. 43, 237-243 (2015).
- Ziemert, N., et al. The natural product domain seeker NaPDoS: a phylogeny based bioinformatic tool to classify secondary metabolite gene diversity. PLoS One. 7 (3), 34064 (2012).
- Rausch, C., Weber, T., Kohlbacher, O., Wohlleben, W., Huson, D. H. Specificity prediction of adenylation domains in nonribosomal peptide synthetases (NRPS) using transductive support vector machines (TSVMs). Nucleic Acids Res. 33 (18), 5799-5808 (2005).
- Röttig, M., et al. NRPSSpredictor2–a web server for predicting NRPS adenylation domain specificity. Nucleic Acids Res. 39, 362-367 (2011).
- Medema, M. H., et al. Minimum Information about a Biosynthetic Gene cluster. Nat. Chem. Biol. 11 (9), 625-631 (2015).
- Mullis, K., et al. Specific enzymatic amplification of DNA in vitro: the polymerase chain reaction. Cold Spring Harb. Symp. Quant. Biol. 51, 263-273 (1986).
- Bierman, M., et al. Plasmid cloning vectors for the conjugal transfer of DNA from Escherichia coli to Streptomyces spp. Gene. 116 (1), 43-49 (1992).
- Froger, A., Hall, J. E. Transformation of plasmid DNA into E. coli.using the heat shock method. J. Vis. Exp. (6), e253 (2007).
- Bimboim, H. C., Doly, J. A rapid alkaline extraction procedure for screening recombinant plasmid DNA. Nucleic Acids Res. 7 (6), 1513-1523 (1979).
- MacNeil, D. J., et al. Analysis of Streptomyces avermitilis. genes required for avermectin biosynthesis utilizing a novel integration vector. Gene. 111 (1), 61-68 (1992).
- Pospiech, A., Neumann, B. A versatile quick-prep of genomic DNA from Gram-positive bacteria. Trends Genet. 11 (6), 217-218 (1995).
- Makitrynskyy, R., et al. Pleiotropic regulatory genes bldA, adpA and absB are implicated in production of phosphoglycolipid antibiotic moenomycin. Open Biol. 3 (10), 130121 (2013).
- Kalan, L., et al. A cryptic polyene biosynthetic gene cluster in Streptomyces calvus is expressed upon complementation with a functional bldA gene. Chem. Biol. 20 (10), 1214-1224 (2013).
- Gessner, A., et al. Changing Biosynthetic Profiles by Expressing bldA in Streptomyces Strains. ChemBioChem. 16 (15), 2244-2252 (2015).
