Из натурального продукта до его биосинтетического кластера генов: демонстрация Использование Polyketomycin из<em> Streptomyces diastatochromogenes</em> Tü6028

1. Идентификация Натуральный продукт с Антибиотик собственности Выращивают микроорганизма при различных условиях (например , время, температура, рН, СМИ) после "OSMAC (один штамм-много соединений) подход" 13. Выберите одну среду, в которой наблюдается получения соединения. Выращивают Streptomyces diastatochromogenes Tü6028 при следующих условиях Grow Streptomyces diastatochromogenes штамма Tü6026 на MS планшетах (соевая мука 20 г D-маннита 20 г, MgCl 2 , 10 мМ, 1,5% агар, водопроводная вода 1 л). Привить небольшую петлю спор этого штамма в 20 мл жидкости TSB среды (трипсином соевый бульон 30 г, водопроводная вода 1 л, рН 7,2; предкультуральной среды) в колбе Эрленмейера с спирали. Взболтать колбу на роторной качалке (28 ° C, 180 оборотов в минуту, 2 дня). Привить основной культуры в 100 мл среды HA (глюкоза 4 г, дрожжевой экстракт 4 г, солодэкстракт 10 г, водопроводную воду 1 л, рН 7,2) с 2 мл предварительной культуры. Культура деформация при 28 ° С в течение 6 дней на роторной качалке при 180 оборотах в минуту. Приготовление сырого экстракта Урожай клетки центрифугированием (10 мин, 3000 XG). Для последующих шагов обрабатывать органические растворители под вытяжкой. Для извлечения соединения из мицелия, ресуспендирования клеток в двукратном объеме ацетона и трясти в трубке в течение 30 мин, 180 оборотов в минуту. Фильтр жидкости через коммерческие бумаги фильтруют и выпаривают ацетон в роторном испарителе при 40 ° С и 550 бар. Растворить экстракт в 20 мл воды: этилацетат (1: 1) и трясти ее в делительную воронку в течение 30 мин при 180 оборотах в минуту. При экстракции соединения из культуральной среды, регулировать культурального бульона до рН 4,0 добавлением 1 М HCl. Добавить 100 мл этилацетата, а трясти ее в делительную воронку в течение 30 мин, 180 оборотов в минуту. Собирают этилацетатной фазы и испаряются гнилью ичных испарения при 40 ° C и 240 бар. Анализ неочищенного экстракта с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии Растворите экстракты в 1 мл MeOH, фильтровать их через фильтр с размером пор 0,45 мкм пор и запустить высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) 14. В случае polyketomycin, оборудовать систему ВЭЖХ с С18 предколонкой (4,6 х 20 мм 2) и колонке С18 (4,6 х 100 мм 2). С помощью линейного градиента ацетонитрила + 0,5% уксусной кислоты в диапазоне от 20% до 95% в H 2 O + 0,5% (расход: 0,5 мл мин -1) уксусной кислоты. Примечание: Polyketomycin имеет время удерживания 25,9 мин (см Фигура 1А). UV / VIS спектр имеет максимумы при 242 нм, 282 нм, 446 нм и минимумы при 262 нм и 359 нм (рис 1В). В отрицательном модусе массой от 863,2 [МН] – можно обнаружить (см рисунок 1С). "SRC =" / файлы / ftp_upload / 54952 / 54952fig1.jpg "/> Рисунок 1: LC / MS анализ Polyketomycin. (А) хроматограмма высокоэффективной жидкостной хроматографии (λ = 430 нм) неочищенного экстракта после культивирования Streptomyces diastatochromogenes Tü6028 в течение 6 дней. Polyketomycin имеет время удерживания 25,9 мин (В) UV / VIS спектры Polyketomycin. (C) Масс – спектры Polyketomycin в отрицательном модусе. Основной пик с т / г 863,2 [MH] -. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры. Определение активности антибиотика с помощью диффузионного диска анализа Привить тестовые штаммы , такие как грамположительных бактерий Bacillus Сенная (в LB среде; LB 20 г, водопроводная вода 1 л, рН 7,4) и другие штаммы Streptomyces (в TSB среде; трипсином соевого бульона , 30 г, водопроводная вода 1 л, рН 70,2), грамотрицательные бактерии кишечной палочки (в LB среде) и грибковые штаммы (в средах , таких как YPD среде, дрожжевой экстракт 10 г, пептон 20 г, глюкоза 20 г, водопроводная вода 1 л, рН 7,4). Взять 100 мкл тестируемого штамма предкультурой и распределить их на соответствующие чашки с агаром. Растворение сырого экстракта или очищенного соединения в 500 мкл метанола (в качестве альтернативы воде или ДМСО) и пипетка 20-50 мкл на стерильные бумажные диски. Сухие бумажные диски в течение 30 мин под верстак и поместить их на пластины с тест-культур. Приготовьте отрицательный контроль (растворитель) и положительного контроля (антибиотик, например , апрамицин [1 мг]). Инкубируйте пластин при соответствующих условиях, пока тестовые штаммы не заметно выросли и определяют зону ингибирования, если очевидно. Выдержите E.coli и Bacillus зр. при 37 ° С в течение 16 ч, Streptomyces Sp. при 28 ° С в течение 2-4 дней, грибковый штамм (в основном зависит от точного критерия деформации) ат 30 ° С в течение 2-х дней). 2. Крупномасштабная добыча, очистка и структура Выяснение соединения Выращивают S. diastatochromogenes в 5 л HA среды (глюкоза 4 г, дрожжевой экстракт 4 г, солодовый экстракт 10 г, водопроводная вода 1 л, рН 7,2). Инокулируйте 2 мл предварительной культуры в 30-х 500 колб Эрленмейера мл, содержащих 150 мл среды HA. Выдержите деформация при 28 ° С в течение 6 дней на ротационном шейкере со скоростью 180 оборотов в минуту. Урожай клетки центрифугированием (10 мин, 15000 XG, RT) и экстракт соединений с использованием этилацетата (смотри раздел 1.3). Рисунок 2: Поток операций для установления структуры. Способ включает (1) культивирование штамма, (2) экстракции, (3) очистка с помощью твердофазной экстракции (SPE), тонкослойной хроматографии (ТСХ), препаративной высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ), размерхроматографии с исключением (SEC), и (4) СТРОЕНИЯ с помощью масс-спектрального анализа (МС), ядерного магнитного резонанса (ЯМР) и измерений рентгеновского излучения. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры. Очистка Polyketomycin ПРИМЕЧАНИЕ: Процесс очистки и установления структуры показана на рисунке 2. Фракционирования сырой экстракт по колонке С18 твердофазной экстракции (SPE) с использованием 10% MeOH -stepwise градиент в диапазоне от 30% до 100% MeOH в H 2 O, 100 мл для каждого условия. Очищают соединение фракции , содержащей далее с помощью препаративной тонкослойной хроматографии (ТСХ) с использованием 15 CH 2 Cl 2 / MeOH (7: 1) в качестве системы элюции. Очищают соединение с помощью препаративной ВЭЖХ 16. Оборудуйте систему ВЭЖХ с С18 предколонкой (5 мкм, 9,4 х 20 мм) иосновная колонка (5 мкм, 9,4 х 150 мм). Используйте градиент ацетонитрила + 0,5% уксусной кислоты в диапазоне от 20% до 95% в H 2 O + 0,5% уксусной кислоты (скорость потока: 2,0 мл / мин). Для удаления растворителей и других мелких примесей, выполнить последнюю стадию очистки с помощью вытеснительной хроматографии с использованием колонки в MeOH 17. Собирают окончательное чистое соединение и испаряться МеОН на роторном испарителе при 40 ° С и 240 бар. Структура выяснение Растворите чистое соединение (более 2 мг) в 600-700 мкл ( в зависимости от машины) или ДМСО – d6, запись 1D ЯМР (1 Н, 13 С) и 2D – ЯМР (HSQC, НМВС, 1 Н- 1 H COSY) спектры на спектрометре ЯМР 18. Экспресс химические сдвиги в & delta значений (частей на миллион), используя ДМСО – d6. Запись масс – спектр высокого разрешения (HRESI-MS) 19 polyketomycin с использованием высокого разрешениямасс-спектрометр. Поясним структуру путем интерпретации результатов анализа ЯМР и МС 10. 3. предложить биосинтетических модель нового выделенного соединения Анализ структуры выделенного соединения и предсказать ферменты, которые могут быть вовлечены в его биосинтеза. Назначают их поликетидный (тип I, II или III), нерибосомальных синтеза пептидов, lantipeptide, терпеноида или метаболизм сахара пути 8. Пример polyketomycin Подразделите структуру в очевидных одиночных фрагментов: тетрациклическое части, две моносахаридов и диметилового салициловой кислоты. Выясните, где фрагменты могут быть получены из: тетрациклический фрагмент могут быть получены из типа поликетидсинтаза II и диметиловый фрагмент салициловой кислоты могут быть получены с помощью итерационной поликетидный типа синтазы I. Две сахарные группы, которые являются 6-дезоксисахаров , может быть synthesiЗед из глюкозы с участием TDP-глюкоза-4,6-дегидратазе в процессе биосинтеза и приложенные к нему , вероятно , двумя гликозилтрансферазами (смотри рисунок 3) 8. Предсказать предположительные генов в кластере. Подумайте ферментов, которые участвуют в синтезе отдельных фрагментов, при установлении соединения блоков, а также в модификации и адаптации молекулы. Ген биосинтетическая кластер Polyketomycin наиболее вероятно , содержит гены , кодирующие тип поликетидсинтаза II (поэтому минимальный АСР, KS α унд KS & beta для подключения расширителей единиц), итеративный типа поликетидсинтаза I ( по крайней мере , ACP, AT, KS), A TDP-глюкоза-4,6-дегидратазы (необходимо для стадии: глюкоза → дезоксиглюкозы) и два гликозилтрансферазы (имеется два сахарных мономеров с агликоном) 8. Рисунок 3: Структура Polyketomycin дивидеэд в единые строительные блоки. Polyketomycin состоит из тетрациклическое decaketid (ПКС тип II) и диметиловый салициловой кислоты (итеративный ПКС тип I), связанный с двумя deoxysugar остатками β-D-amicetose и & alpha; -L-axenose (NDP-глюкоза-4,6- дегидратазе и требуется два гликозилтрансферазу). Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры. 4. секвенированию генома / Mining Следующее поколение секвенирования Последовательность геномной ДНК с помощью технологии секвенирования следующего поколения , как Illumina, 454 Пиросеквенирование или SOLiD 20. Выравнивание одного читает эталонной последовательности или собрать заново. ПРИМЕЧАНИЕ: геном S. diastatochromogenes Tü6028 секвенировали в Центре биотехнологии (CeBiTec) в Университете Билефельда. Все читает были собраны на проект генома7,9 Mb. добыча Геном Поиск открытых рамок считывания (ORFs) путем использования, например , NCBI прокариотических генома Аннотация трубопровода 21,22, РАСТ (быстрое аннотаций с использованием подсистемы технологии) 23,24,25, Prokka (быстрое прокариотической геном аннотацию) 26 или GENDB 27. Эти программы также предлагают свои функции. Анализ S. diastatochromogenes Tü6028 последовательность генома проект привел к идентификации более чем 7000 ORF , . Запуск конкретных BLAST (Basic Local Alignment Search Tool) анализ , чтобы получить более подробную информацию , как выравниваний с другими подобными генами и каталитических доменов 28,29,30. Для идентификации гена метаболит программ вторичного кластера бегут как antiSMASH 31,32,33, NaPDoS 34 и NRPSpredictor 35,36. В проекте генома Streptomyces diastatochromogenes antiSMASH 31,32,33 IdentiFied 22 кластеров генов. Анализ мнимые генных кластеров для их ферментативного пути (ов) (поликетидсинтаза (тип I, II или III) нерибосомальных пептид-синтетазы, lanthipeptide, терпеноидов, метаболизм сахара …). Поиск кластера (ов), содержащих гены, которые могут быть вовлечены в синтезе соединения (смотри раздел 3). В S. diastatochromogenes аннотированный кластер 2 содержит поликетидный Type – синтазы гены II, три поликетидный типа синтазы I генов, ген TDP-глюкоза-4,6-дегидратазы и два гена гликозилтрансферазу (смотри рисунок 4). Фокус на отдельных генов в кластере. Для типа I PKS и NRPS специфичность ацилтрансферазы и adenylation доменов, и, таким образом, включение одного расширители единиц, могут быть предсказаны. Также сравните порядок объединенного блока расширителя с молекулой. antiSMASH 31,32,33 также показывает аналогичные кластеры уже известных соединений, со ссылкой на базу данных MIBiG 37. </li> Сравните структуру соединения с этими другими соединениями и проверить наличие сходства. Рисунок 4: antiSMASH Выход Polyketomycin кластера генов биосинтеза и Обзор других кластеров в S. diastatochromogenes Tü6028. (А) Обзор прогнозируемых биосинтетических кластеров генов в геноме S. diastatochromogenes Tü6028; (Б) Кластер 2 Polyketomycin генов биосинтетических кластера с целевыми генами. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры. 5. Проверка кластера биосинтетического гена Поиск гена с очевидными и важными (существенных) функций для биосинтеза соединения. Для проверки polyketoMYCIN кластер генов ген pokPI, кодирующую ketosynthase альфа от типа ПКС II, был выбран и инактивируют путем из кадра -deletion (смотри рисунок 5B). В качестве альтернативы, прервать ген путем клонирования внутренний фрагмент (см рисунок 5C). Рисунок 5: Проверка кластера генов с помощью единого Crossover. (А) нативный ген приводит к переводу функционального белка; (Б) Клонирование гена с внутренней делецией в вектор суицида приводит к одному кроссовером , что приводит к сдвигу рамки в целевом гене и последующего перевода неактивный белок; (С) Клонирование внутреннего фрагмента гена в вектор суицида приводит к усечения гена и последующего перевода нефункционального белка. Орит: происхождение тransfer; R антибиотик: устойчивость к антибиотикам. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры. Клонирование одного кроссовера конструкции Амплифицировать фрагмент , содержащий pokPI с помощью ПЦР с праймерами 38 pokPI_for и pokPI_rev. Продукт ПЦР – клон в векторе самоубийства pKC1132 39 (апрамицин R [50 мг / мл]). Вектор самоубийство не способен к репликации в штамме Streptomyces и , таким образом , должен интегрировать в геном целевой путем гомологичной рекомбинации , чтобы обеспечить апрамицину резистентность. Перенос вектора в E.coli хоз ине клонировани путем теплового шока трансформации 40. Изолировать вектор с помощью щелочного лизиса 41. Дайджест векторной ДНК с одним режущим ферментом рестрикции, который разрезает внутри фрагмента. PokPI поколенияе расщепляли фермент Kpn I. Лечить переваренной векторной ДНК с большой ДНК-полимеразы I (Кленова) фрагмент, который имеет 5 '→ 3' полимеразной активностью и 3 '→ 5' экзонуклеазной-активность. Притупление липких концов и последующее повторное лигирование приводит к потере четырех оснований. Проверьте потери этих баз путем преобразования шагов в Е.coli XL1 Blue, собирание отдельных колоний, изолируя их ДНК плазмиды, 41 и дальнейшего анализа с помощью расщепления рестриктазами и секвенирования. Сопряжение одноленточного кроссовера конструкции в Streptomyces Перенести вектор самоубийство , содержащий ген pokPI (pKC1132_ pokPI Del) с удалением в E.coli ET12567 pUZ8002 42 (канамицин R) с помощью теплового шока трансформации 40. Инкубируйте клетки в 100 мл LB среды (канамицин 50 мкг мл -1, апрамицин 50 мкг мл -1 </sup>) В течение ночи при 37 ° С. Урожай клетки центрифугированием (3000 XG, 10 мин, 4 ° С) и мыть клетки дважды ресуспендирования в 50 мл LB-носителей. И, наконец, ресуспендирования клеток в 2 х 500 мкл LB сред. Смешайте 500 мкл кишечной палочки pUZ8002 pKC1132_ pokPI дель 500 мкл Streptomyces diastatochromogenes культуры ( в качестве альтернативы использовать споры). Распространение смесь на MS планшетах (соевая мука 20 г D-маннита 20 г, MgCl 2 , 10 мМ, 1,5% агар, водопроводная вода 1 л). Инкубируйте пластин в течение 20 ч при 28 ° С. Перекрытие каждую пластину с апрамицину (1,25 мг) и фосфомицина (5 мг), растворенный в 1 мл воды и дайте им высохнуть. Инкубируйте пластин в течение нескольких дней при температуре 28 ° C до эксконъюгантов не видно. Проверка одного кроссовера мутантов Привить одиночные эксконъюгантов в 20 мл среды TSB (апрамицин 50 мг мл -1) и инкубировать их при 28 ° С в течение трех дней и 180 оборотов в минуту. Изолировать геномную ДНК 43 и проверить прерывание гена pokPI с помощью ПЦР. Инокулируйте отдельные клоны с проверенными прерыванием гена и Streptomyces дикого типа штамма в 100 мл среды HA и инкубировать их в течение 6 дней при 28 ° С и 180 оборотах в минуту. Извлечение неочищенного экстракта (смотри раздел 1.3). Проверка производства соединение с помощью анализа ВЭЖХ-МС (см раздел 1.4). Соответствующий пик в хроматограмме ВЭЖХ и массу соединения не должно быть обнаружено больше (рисунок 6). Рисунок 6: Анализ ВЭЖХ С. diastatochromogenes с инактивированной pokPI гена. Хроматограмма ВЭЖХ (λ = 430 нм) неочищенного экстракта S. diastatochromogenes WT (сверху) и мутантного штамма с прерванного pokPI -GEN (ниже). Мутантный штамм не производит polyketomycin больше.Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.