Van een natuurlijk product om Zijn Biosynthetisch Gene Cluster: Een demonstratie met behulp van Polyketomycin<em> Streptomyces diastatochromogenes</em> Tü6028

1. Identificatie van een natuurlijk product met antibiotica Property Cultiveren een micro-organisme onder verschillende omstandigheden (bijvoorbeeld, temperatuur, pH, media) na de "OSMAC (een stam-vele verbindingen) benadering" 13. Selecteer een medium waarin de productie van een verbinding wordt waargenomen. Cultiveren Streptomyces diastatochromogenes Tü6028 onder de volgende voorwaarden Grow Streptomyces diastatochromogenes Tü6026 druk op MS platen (sojameel 20 g, D-mannitol 20 g, MgCl2 10 mM, agar 1,5%, leidingwater 1 L). Inoculeer een kleine lus van de sporen van deze stam in 20 ml vloeibare TSB medium (tryptische soja bouillon 30 g, leidingwater 1 L, pH 7,2; voorkweek medium) in een erlenmeyer met een spiraal. Schud de kolf op een roterend schudapparaat (28 ° C, 180 rpm, 2 dagen). Inoculeer belangrijkste cultuur in 100 ml HA medium (glucose 4 g, gistextract 4 g, moutextract 10 g, leidingwater 1 L, pH 7,2) met 2 ml van de voorkweek. Kweek de stam bij 28 ° C gedurende 6 dagen op een roterende schudder bij 180 rpm. Bereiding van het ruwe extract Oogst cellen door centrifugatie (10 min, 3000 x g). Voor de volgende stappen te behandelen organische oplosmiddelen onder een zuurkast. Voor samengestelde extractie van het mycelium, resuspendeer cellen in een tweevoudige volume aceton toe en schud een buis voor 30 min, 180 rpm. Filtreer de vloeistof door commerciële filtreerpapier en damp aceton door roterende verdamper bij 40 ° C en 550 bar. Los het extract in 20 ml water: ethylacetaat (1: 1) en schud in een scheitrechter gedurende 30 minuten bij 180 rpm. Voor samengestelde winning uit het kweekmedium, stel de kweekbouillon tot pH 4,0 door toevoeging van 1 M HCl. Voeg 100 mL ethylacetaat en schud in een scheitrechter gedurende 30 min, 180 rpm. Verzamel ethylacetaatfase en verdampen door rot ary verdamping bij 40 ° C en 240 bar. Analyse van het ruwe extract met HPLC Los de extracten in 1 ml MeOH, filteren door een 0,45 um poriegrootte filter en run High-Performance Liquid Chromatography (HPLC) 14. Bij polyketomycin, rust de HPLC systeem met een C18 voorkolom (4,6 x 20 mm 2) en een C18-kolom (4,6 x 100 mm 2). Gebruik een lineaire gradiënt van acetonitril + 0,5% azijnzuur varieert van 20% tot 95% in H2O + 0,5% azijnzuur (stroomsnelheid: 0,5 ml min -1). OPMERKING: Polyketomycin heeft een retentietijd van 25,9 min (zie figuur 1A). Het UV / VIS spectrum maxima bij 242 nm, 282 nm, 446 nm en minima bij 262 nm en 359 nm (zie figuur 1B). In de negatieve modus een massa van 863,2 [MH] – detecteerbaar is (zie figuur 1C). "Src =" / files / ftp_upload / 54952 / 54952fig1.jpg "/> Figuur 1: LC / MS analyse van Polyketomycin. (A) HPLC chromatogram (λ = 430 nm) van het ruwe extract na kweken van Streptomyces diastatochromogenes Tü6028 gedurende 6 dagen. Polyketomycin heeft een retentietijd van 25,9 min (B) UV / Vis spectra van Polyketomycin. (C) Massa spectra van Polyketomycin in de negatieve modus. Belangrijkste piek met m / z 863,2 [MH] -. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. Identificatie van het antibioticum activiteit met disc diffusion assay Inoculeer testen stammen, zoals Gram-positieve bacterie Bacillus subtilis (in LB-medium; LB 20 g, leidingwater 1 L, pH 7,4) en andere Streptomyces stammen (in TSB-medium; tryptische soja bouillon 30 g, leidingwater 1 L, pH 70,2), Gram-negatieve bacterie Escherichia coli (in LB-medium) en schimmelstammen (in media zoals YPD medium gistextract 10 g, 20 g pepton, glucose 20 g, leidingwater 1 L, pH 7,4). Neem 100 ul van de test stam precultuur en verdeel ze op respectievelijke agarplaten. Ontbinding van de ruwe extract of gezuiverde verbinding in 500 ul van methanol (alternatief water of DMSO) en pipet 20-50 pi op steriele papier schijven. Droog papier schijven gedurende 30 minuten onder de werkbank en leg ze op de platen met testculturen. Bereid een negatieve controle (oplosmiddel) en een positieve controle (antibioticum, bijv apramycin [1 mg]). Incubeer de platen onder passende voorwaarden, totdat de test stammen zichtbaar worden gekweekt en het bepalen van de remming zone, indien duidelijk. Incubeer E. coli en Bacillus sp. bij 37 ° C gedurende 16 uur, Streptomyces sp. bij 28 ° C gedurende 2-4 dagen, schimmelstam (hoofdzaak op exact test stam) eent 30 ° C gedurende 2 dagen). 2. Large Scale Winning, zuivering en structuuropheldering van de verbinding Cultiveren S. diastatochromogenes in 5 L HA medium (glucose 4 g, gistextract 4 g, mout extract 10 g, leidingwater 1 L, pH 7,2). Inoculeer 2 ml van de voorkweek in 30 x 500 ml erlenmeyers die 150 ml HA medium. Incubeer de stam bij 28 ° C gedurende 6 dagen op een roterende schudder bij 180 rpm. Oogst cellen door centrifugeren (10 minuten, 15.000 xg, RT) en extract verbindingen met behulp van ethylacetaat (zie paragraaf 1.3). Figuur 2: Workflow voor structuuropheldering. De werkwijze omvat (1) het kweken van de stam, (2) extractie, (3) zuivering door vastefase-extractie (SPE), dunnelaagchromatografie (TLC), preparatieve vloeistofchromatografie (HPLC), grootteuitsluitingschromatografie (SEC) en (4) structuuropheldering massa-analyse (MS), kernmagnetische resonantie (NMR) en X-ray metingen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. Zuivering van Polyketomycin Opmerking: Het proces van zuivering en structuuropheldering is weergegeven in figuur 2. Fractioneren ruw extract van een kolom C18 vastefase-extractie (SPE) met een 10% -stepwise MeOH gradiënt van 30% tot 100% MeOH in H 2 O, 100 ml voor elke conditie. Zuiver de verbinding bevattende fractie verder door preparatieve dunnelaagchromatografie (TLC) 15 middels CH 2Cl 2 / MeOH (7: 1) als eluens systeem. Zuiver de verbinding door middel van preparatieve HPLC 16. Rust de HPLC systeem met een C18 voorkolom (5 urn, 9,4 x 20 mm) en eenhoofdkolom (5 urn, 9,4 x 150 mm). Met een gradiënt van acetonitril + 0,5% azijnzuur varieert van 20% tot 95% in H2O + 0,5% azijnzuur (stroomsnelheid: 2,0 ml / min). Oplosmiddelen en andere kleine verontreinigingen te verwijderen, voert een laatste zuiveringsstap door gelpermeatiechromatografie onder toepassing van een kolom in MeOH 17. Verzamel de uiteindelijke zuivere verbinding en damp MeOH door roterende verdamping bij 40 ° C en 240 bar. structuuropheldering Los het zuivere verbinding (meer dan 2 mg) in 600-700 gl (afhankelijk van de machine) van DMSO-d6, opnemen 1D NMR (1 H, 13 C) en 2D NMR (HSQC, HMBC, 1 H 1 H COSY) spectra op een NMR-spectrometer 18. Drukken chemische verschuivingen in δ waarden (ppm) met DMSO-d6. Neem een hoge-resolutie massaspectrum (HRESI-MS) 19 van polyketomycin behulp van een hoge-resolutiemassaspectrometer. Ophelderen van de structuur door interpretatie van de resultaten van NMR en MS gegevensanalyse 10. 3. Voorstellen Biosynthetisch Model van de Nieuwe geïsoleerde Compound Analyseer de structuur van de geïsoleerde verbinding en voorspellen enzymen, die kunnen worden betrokken bij de biosynthese. Toewijzen aan polyketide (type I, II of III), niet-ribosomale peptide synthese lantipeptide, terpenoïde of suikermetabolisme traject 8. voorbeeld polyketomycin Splits de structuur in de hand liggende enkele groepen: tetracyclische deel, twee mono- en de dimethyl salicylzuur. Informatie, waarbij de eenheden worden afgeleid uit: De tetracyclische eenheid kan voortvloeien uit een polyketide synthase type II en dimethyl salicylzuur groep kan worden verkregen door een iteratieve polyketide synthase Type I. De twee suikereenheden, die 6-deoxysugars zijn kan worden synthesized van glucose met een TDP-glucose-4,6-dehydratase tijdens biosynthese en waarschijnlijk verbonden door twee glycosyltransferasen (zie figuur 3) 8. Voorspel vermeende genen in het cluster. Denk aan enzymen die betrokken zijn bij de synthese van de enkele groepen in aansluiting van de apparaten en bij het modificeren en afstemmen van de molecule. De biosynthetische gencluster van Polyketomycin bevat waarschijnlijk genen die coderen voor een polyketide synthase type II (dus minimaal een ACS, KS α und KS β voor het aansluiten van extender eenheden), een iteratieve het type polyketide synthase I (althans ACP, AT, KS), een TDP-glucose-4,6-dehydratase (noodzakelijk voor stap: glucose → deoxyglucose) en twee glycosyltransferases (vastmaken twee suiker monomeren aan het aglucon) 8. Figuur 3: Structuur van Polyketomycin Divided in enkele Building Blocks. Polyketomycin bestaat uit een tetracyclische decaketid (PKS type II) en dimethyl salicylzuur (iteratief PKS type I) toegevoegd door de twee groepen deoxysugar β-D-amicetose en α-L-axenose (NDP glucose-4,6- dehydratase en twee glycosyltransferase vereist). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. 4. Genome Sequencing / Mijnbouw Next generation sequencing Sequentie van het genomische DNA van next generation sequencing technologieën zoals Illumina, 454 pyrosequencing of vast 20. Lijn één leest met een referentie sequentie of assembleren de novo. LET OP: Het genoom van S. diastatochromogenes Tü6028 werd de sequentie van het Center for Biotechnology (CeBiTec) aan de Universiteit van Bielefeld. Alle leest werden samengevoegd tot een ontwerp-genoomvan 7,9 Mb. Genome mining Zoeken naar open reading frames (ORF) door het gebruik van bijvoorbeeld NCBI Prokaryote genoomannotatie Pipeline 21,22, RAST (snelle annotatie met behulp van technologie van het subsysteem) 23,24,25, Prokka (snelle prokaryote genoomannotatie) 26 of GenDB 27. Deze programma's stellen ook hun functies. De analyse van de S. diastatochromogenes Tü6028 ontwerp genoomsequentie geleid tot de identificatie van meer dan 7000 ORFs. Run specifieke BLAST (Basic Local Alignment Search Tool) analyse om meer informatie, zoals groeperingen met andere gelijkaardige genen en katalytische domeinen 28,29,30 te krijgen. Voor de identificatie van de secundaire metaboliet gencluster run programma's zoals antiSMASH 31,32,33, NaPDoS 34 en NRPSpredictor 35,36. In het ontwerp-genoom van Streptomyces diastatochromogenes antiSMASH 31,32,33 identified 22 gen clusters. Analyseer de vermeende genclusters hun enzymatische pathway (s) (polyketide synthase (type I, II of III), niet-ribosomale peptide synthetase, lanthipeptide, terpenoïde, suikermetabolisme …). Zoeken naar cluster (s) die genen die betrokken kunnen worden bij de synthese van de verbinding (zie paragraaf 3). S. diastatochromogenes geannoteerde cluster 2 bevat polyketide synthase genen type II, drie polyketide synthase genen van type I, een TDP-glucose-4,6-dehydratase gen en twee glycosyltransferasegenen (zie figuur 4). Focus op enkele genen binnen het cluster. Voor type I PKS en NRPS de specificiteit van acyltransferasen en adenylatie domeinen, en daarmee de opname van één uitbreidereenheden kan worden voorspeld. Vergelijk ook de volgorde van de gebruikte extender eenheid met het molecuul. antiSMASH 31,32,33 toont ook soortgelijke clusters van reeds bekende verbindingen, met een link naar MIBiG databank 37. </li> Vergelijk de structuur van de verbinding met deze andere verbindingen en controleer overeenkomsten. Figuur 4: antiSMASH Output van Polyketomycin Biosynthetisch Gene Cluster en overzicht van andere clusters in S. diastatochromogenes Tü6028. (A) Algemene beschrijving van de voorspelde biosynthetische genclusters in het genoom van S. diastatochromogenes Tü6028; (B) Cluster 2 Polyketomycin biosynthetische gencluster met gerichte genen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. 5. Controle van de Biosynthetisch Gene Cluster Zoeken naar een gen met duidelijke en belangrijke (essentiële) functies biosynthese van de verbinding. Voor de verificatie van de polyketomycin gencluster het gen pokPI, codeert voor het ketosynthase α uit de PKS type II, werd geselecteerd en geïnactiveerd door een uit frame -deletie (zie figuur 5B). Als alternatief, onderbreken het gen door het klonen van een intern fragment (zie figuur 5C). Figuur 5: Verificatie van een Gene Cluster door Single Crossover. (A) natief gen leidt tot de translatie van een functioneel eiwit; (B) Klonering van het gen met interne deletie in een zelfmoordvector leidt tot een crossover resulteert in een faseverschuiving in het doelgen en vervolgens translatie van niet-functioneel eiwit; (C) Klonering van een intern fragment van het gen in een zelfmoordvector leidt tot afknotting van het gen en daaropvolgende translatie van een niet-functioneel eiwit. oriT: oorsprong van transfer; antibiotica R: antibioticaresistentie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. Klonen van de single-crossover construct Amplify een fragment dat pokPI door PCR 38 met primers pokPI_for en pokPI_rev. Clone PCR product in zelfmoordvector pKC1132 39 (apramycin R [50 mg / ml]). De zelfmoordvector niet kan repliceren in de Streptomyces stam en heeft dus te integreren in het doelgen door homologe recombinatie apramycin-weerstand. Breng de vector in E. coli klonen gastheer door heat shock transformatie 40. Isoleer de vector door middel van alkalische lysis 41. Digest het vector DNA met een restrictie enzym dat mes knipt binnen het fragment. De pokPI gene werd gedigereerd met enzym KpnI Behandel gedigereerd DNA vector met grote DNA-polymerase I (Klenow) fragment, dat 5 '→ 3' polymerase activiteit en 3 '→ 5' exonuclease-activiteit. Afstomping van de overhangende uiteinden en daaropvolgende hernieuwde ligatie leidt tot verlies van vier basen. Controleer op verlies van deze bases stappen transformatie in E. coli XL1 Blue, plukken afzonderlijke kolonies, isoleren van plasmide-DNA ervan, 41 en verdere analyse door middel van restrictiedigestie en sequentiebepaling. Vervoeging van het single-crossover construct in Streptomyces Breng de zelfmoord vector die het pokPI gen (pKC1132_ pokPI del) met deletie in E. coli ET12567 pUZ8002 42 (kanamycine R) door heat shock transformatie 40. Incubeer de cellen in 100 ml LB-medium (kanamycine 50 ug ml-1, apramycin 50 ug ml -1 </sup>) Overnacht bij 37 ° C. Oogst cellen door centrifugeren (3000 x g, 10 min, 4 ° C) en was cellen tweemaal door resuspenderen in 50 ml LB-medium. Tenslotte hersuspenderen cellen 2 x 500 pi LB media. Meng 500 pi E. coli pUZ8002 pKC1132_ pokPI del met 500 pi Streptomyces diastatochromogenes cultuur (als alternatief te gebruiken sporen). Spreid het mengsel over MS platen (sojameel 20 g, D-mannitol 20 g, MgCl2 10 mM, agar 1,5%, leidingwater 1 L). Incubeer de platen gedurende 20 uur bij 28 ° C. Overlay elke plaat met apramycin (1,25 mg) en fosfomycin (5 mg) opgelost in 1 ml water en laat ze drogen. Incubeer de platen gedurende enkele dagen bij 28 ° C tot exconjugants zichtbaar. Controleer single-crossover mutanten Inoculeer één exconjugants in 20 ml TSB-medium (apramycin 50 mg ml-1) en incubeer ze op 28 ° C gedurende drie dagen en 180 rpm. Isoleer genoom DNA 43 en controleer of onderbreking van de pokPI-gen door PCR. Inoculeer enkele klonen met geverifieerde genonderbreking en Streptomyces wildtype stam in 100 ml HA medium en incubeer ze gedurende 6 dagen bij 28 ° C en 180 rpm. Pak het ruwe extract (zie paragraaf 1.3). Controleer verbinding productie door middel van HPLC-MS-analyse (zie paragraaf 1.4). De overeenkomstige piek in het HPLC-chromatogram en de massa van de verbinding niet meer aantoonbaar zijn (zie figuur 6). Figuur 6: HPLC analyse van S. diastatochromogenes met geïnactiveerde pokPI Gene. HPLC chromatogram (λ = 430 nm) ruw extract van S. diastatochromogenes WT (boven) en mutante stam met onderbroken pokPI Gen. (hieronder). De mutante stam niet meer produceren polyketomycin.Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.