A partir de un producto natural a su cluster biosintético Gen: Una demostración del uso de Polyketomycin<em> Streptomyces diastatochromogenes</em> Tü6028

1. Identificación de un producto natural con Antibiótico Propiedad Cultivar un microorganismo en diferentes condiciones (por ejemplo, tiempo, temperatura, pH, medios de comunicación) después de la "OSMAC (una cepa de muchos compuestos) enfoque" 13. Seleccionar un medio en el que se observa la producción de un compuesto. Cultivar Streptomyces diastatochromogenes Tü6028 bajo las siguientes condiciones Crecer Streptomyces diastatochromogenes cepa Tü6026 sobre placas MS (harina de soja 20 g, D-manitol 20 g, MgCl2 10 mM, 1,5% de agar, el agua del grifo 1 l). Inocular un pequeño bucle de las esporas de esta cepa en 20 ml de medio TSB líquido (caldo de soja tríptico 30 g, agua del grifo 1 L, pH 7,2; medio de precultivo) en un matraz Erlenmeyer con una espiral. Agitar el matraz en un agitador rotatorio (28 ° C, 180 rpm, 2 días). Inocular el cultivo principal en 100 ml de medio de HA (glucosa 4 g, extracto de levadura 4 g, maltaextraer 10 g, agua del grifo 1 L, pH 7,2) con 2 ml del precultivo. Cultivar la cepa a 28 ° C durante 6 días en un agitador rotatorio a 180 rpm. Preparación del extracto crudo Cosecha células por centrifugación (10 min, 3.000 xg). Para los pasos siguientes manejar disolventes orgánicos bajo una campana de humos. Para la extracción de compuesto a partir del micelio, Resuspender las células en un doble volumen de acetona y agitar en un tubo para 30 min, 180 rpm. Se filtra el líquido a través de papel de filtro comercial y se evapora la acetona mediante evaporador rotatorio a 40 ° C y 550 bar. Se disuelve el extracto en 20 ml de agua: acetato de etilo (1: 1) y agitar en un embudo de separación durante 30 minutos a 180 rpm. Para la extracción compuesto del medio de cultivo, ajustar el caldo de cultivo a pH 4,0 mediante la adición de HCl 1 M. Añadir 100 ml de acetato de etilo y agitador en un embudo de separación durante 30 minutos, 180 rpm. Recoger la fase de acetato de etilo y se evapora por la podredumbre evaporación ary a 40 ° C y 240 bar. El análisis del extracto en bruto mediante HPLC Disolver los extractos en 1 ml de MeOH, se filtra a través de un filtro de 0,45 micras de tamaño de poro y ejecutar cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) 14. En el caso de polyketomycin, equipar el sistema de HPLC con una precolumna C18 (4,6 x 20 mm 2) y una columna C18 (4,6 x 100 mm 2). Utilice un gradiente lineal de acetonitrilo en ácido acético + 0,5% que van desde 20% a 95% en H 2 O + 0,5% (velocidad de flujo: 0,5 ml min -1) acético. NOTA: Polyketomycin tiene un tiempo de retención de 25,9 min (véase la Figura 1A). El espectro de UV / vis tiene máximos a 242 nm, 282 nm, 446 nm y mínimos a 262 nm y 359 nm (véase la Figura 1B). En el modus negativo una masa de 863.2 [MH] – es detectable (véase la Figura 1C). "Src =" / files / ftp_upload / 54952 / 54952fig1.jpg "/> Figura 1: LC / MS Análisis de Polyketomycin. (A) HPLC cromatograma (λ = 430 nm) del extracto crudo después del cultivo de Streptomyces diastatochromogenes Tü6028 durante 6 días. Polyketomycin tiene un tiempo de retención de 25,9 min UV (B) / vis espectros de Polyketomycin. (C) Los espectros de masas de Polyketomycin en el modus negativo. Pico principal con m / z 863,2 [MH] -. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Identificación de la actividad antibiótica utilizando el ensayo de difusión en disco Inocular cepas de prueba como Gram-positivos subtilis bacteria Bacillus (en medio LB; LB 20 g, agua del grifo 1 L, pH 7,4) y otras cepas de Streptomyces (en medio TSB; caldo de soja tríptico 30 g, agua del grifo 1 L, pH 70.2), las bacterias Gram-negativas Escherichia coli (en medio LB) y las cepas fúngicas (en medios tales como el medio YPD; extracto de levadura 10 g, peptona 20 g, glucosa 20 g, grifo de agua 1 L, pH 7,4). Tomar 100 l de prueba de tensión pre-cultivo y repartirlos sobre las respectivas placas de agar. Se disuelve el extracto en bruto o compuesto purificado en 500 l de metanol (alternativamente agua o DMSO) y la pipeta 20 hasta 50 l en discos de papel estéril. discos de papel seco durante 30 minutos bajo la mesa de trabajo y ponerlos en las placas con cultivos de ensayo. Preparar un control negativo (solvente) y un control positivo (antibiótico, por ejemplo, apramicina [1 mg]). Las placas se incuban en condiciones adecuadas hasta que las cepas de prueba se cultivan de forma visible y determinar la zona de inhibición, si es aparente. Incubar E. coli y Bacillus sp. a 37 ° C durante 16 h, Streptomyces sp. a 28 ° C durante 2-4 días, cepa fúngica (depende principalmente de la cepa de prueba exacta) unat 30 ° C durante 2 días). 2. La extracción a gran escala, purificación y elucidación de la estructura del Compuesto Cultivar S. diastatochromogenes en medio de 5 l HA (glucosa 4 g, extracto de levadura 4 g, extracto de malta 10 g, el agua del grifo 1 L, pH 7,2). Inocular 2 ml del cultivo previo en 30 x 500 ml frascos Erlenmeyer conteniendo 150 ml de medio de HA. Incubar la cepa a 28 ° C durante 6 días en un agitador rotatorio a 180 rpm. Cosecha células por centrifugación (10 min, 15.000 xg, RT) y los compuestos de extractos utilizando acetato de etilo (ver sección 1.3). Figura 2: Flujo de trabajo para la elucidación estructural. El procedimiento comprende (1) el cultivo de la cepa, (2) extracción, (3) la purificación por extracción en fase sólida (SPE), cromatografía de capa fina (TLC), cromatografía líquida de alto rendimiento preparativa (HPLC), el tamañocromatografía de exclusión (SEC) y (4) elucidación de la estructura por análisis de masas (MS), resonancia magnética nuclear (RMN) y mediciones de rayos X. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Purificación de Polyketomycin NOTA: El proceso de purificación y elucidación de la estructura se muestra en la Figura 2. Fraccionar el extracto en bruto mediante una columna de extracción en fase sólida C18 (SPE) usando un gradiente de 10% -stepwise MeOH que van desde 30% a 100% de MeOH en H 2 O, 100 ml para cada condición. Se purifica la fracción que contiene el compuesto de nuevo por cromatografía preparativa en capa fina (TLC) 15 usando CH 2 Cl 2 / MeOH (7: 1) como sistema de elución. Se purifica el compuesto por HPLC preparativa 16. Equipar el sistema de HPLC con una precolumna C18 (5 m; 9,4 x 20 mm) y unacolumna principal (5 m; 9,4 x 150 mm). Utilice un gradiente de ácido acético acetonitrilo + 0,5% que van desde 20% a 95% en ácido acético H 2 O + 0,5% (velocidad de flujo: 2,0 ml / min). Para eliminar los disolventes y otras impurezas pequeñas, lleve a cabo una última etapa de purificación por cromatografía de exclusión de tamaño utilizando una columna en MeOH 17. Recoger el compuesto puro final y evaporar MeOH por evaporación rotativa a 40 ° C y 240 bar. estructura elucidación Se disuelve el compuesto puro (más de 2 mg) en 600 a 700 l (dependiendo de la máquina) de DMSO-d 6, ficha 1D de RMN (1 H, 13 C) y RMN 2D (HSQC, HMBC, 1 H- 1 H COSY) los espectros de RMN en un espectrómetro 18. Expresar los desplazamientos químicos en los valores de delta (ppm) mediante el uso de DMSO-d 6. Registrar un espectro de masas de alta resolución (HRESI-MS) 19 de polyketomycin utilizando una alta resoluciónespectrómetro de masas. Elucidar la estructura por la interpretación de los resultados del análisis de los datos de RMN y MS 10. 3. Proponer biosintética Modelo del Nuevo compuesto aislado Analizar la estructura del compuesto aislado y predecir las enzimas, que pudieran estar implicados en su biosíntesis. Asignarlos a policétido (tipo I, II o III), la síntesis de péptido no ribosomal, lantipeptide, terpenos, o azúcar vía metabolismo 8. ejemplo polyketomycin Subdividir la estructura en mitades individuales obvias: fracción tetracíclicos, dos monosacáridos y el ácido salicílico dimetilo. Descubre, donde los restos pueden ser derivadas de: El resto tetracíclico podría derivarse de un tipo de poliquétido sintasa II y el resto de ácido salicílico de dimetilo puede ser derivado por un iterativo policétido sintasa de tipo I. Los dos restos de azúcares, que son 6-desoxiazúcares , podrían ser SYNTHESIzeta a partir de glucosa implica un-glucosa-4,6-deshidratasa TDP durante la biosíntesis y unido probablemente por dos glicosiltransferasas (véase la Figura 3) 8. Predecir los genes putativos de la agrupación. Piense de enzimas que están implicadas en la síntesis de los restos individuales, en la conexión de las unidades, así como en la modificación y la adaptación de la molécula. La agrupación de genes biosintéticos de Polyketomycin muy probablemente contiene los genes que codifican una policétido sintasa tipo II (por lo tanto mínimo un ACP, KS α und KS β para conectar unidades de elongación), un proceso iterativo tipo policétido sintasa I (al menos ACP, AT, KS), una TDP-glucosa-4,6-deshidratasa (necesaria para el paso: la glucosa → desoxiglucosa) y dos glicosiltransferasas (adjuntando dos monómeros de azúcar a la aglicona) 8. Figura 3: Estructura del Polyketomycin Divided en simples bloques de construcción. Polyketomycin se compone de un decaketid tetracíclico (PKS de tipo II) y un ácido salicílico de dimetilo (iterativo tipo PKS I), unidos por los dos restos desoxiazúcar β-D-amicetose y α-L-axenose (NDP-glucosa-4,6- deshidratasa y dos glicosiltransferasa necesario). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. 4. Secuenciación del Genoma / Minería Secuenciación de próxima generación Secuenciar el ADN genómico mediante tecnologías de secuenciación de próxima generación, como Illumina, 454 pirosecuenciación 20 o sólido. Alinear solo lee a una secuencia de referencia o ensamblar de novo. NOTA: El genoma de S. diastatochromogenes Tü6028 se secuenció en el Centro de Biotecnología (CeBiTec) en la Universidad de Bielefeld. Todas las lecturas fueron reunidos para un proyecto de genomade 7,9 Mb. la minería genoma Búsqueda de marcos de lectura abiertos (ORF) por el uso de, por ejemplo, NCBI anotación del genoma procariótico Pipeline 21,22, RAST (rápida anotación utilizando la tecnología del subsistema) 23,24,25, Prokka (rápida anotación del genoma procariótico) 26 o 27 GenDB. Estos programas también proponen sus funciones. El análisis de la secuencia de S. diastatochromogenes Tü6028 proyecto genoma dado lugar a la identificación de más de 7.000 ORF. Ejecutar BLAST específica (Basic Local Alignment Search Tool) análisis para obtener más información como alineaciones con otros genes similares y dominios catalíticos 28,29,30. Para la identificación de los programas dirigidos por el grupo de genes de metabolitos secundarios como antiSMASH 31,32,33, 34 y NaPDoS NRPSpredictor 35,36. En el proyecto de genoma de Streptomyces diastatochromogenes antiSMASH 31,32,33 identicado 22 grupos de genes. Analizar los grupos de genes putativos para su vía (s) enzimática (policétido sintasa (tipo I, II o III), la sintetasa no ribosómica de péptidos, lanthipeptide, terpenoides, el metabolismo del azúcar …). Búsqueda de clúster (s) que contiene genes que podrían estar implicados en la síntesis del compuesto (ver sección 3). En S. diastatochromogenes anotada grupo 2 contiene policétido sintasa tipo II genes, tres policétido sintasa de tipo I genes, un gen TDP-glucosa-4,6-deshidratasa y dos genes de glicosiltransferasa (véase la Figura 4). Centrarse en los genes individuales dentro del grupo. Para el tipo I y PKS NRPS la especificidad de aciltransferasas y dominios de adenilación, y por lo tanto la incorporación de las unidades extensoras sola, puede ser predicho. También comparar la orden de la unidad extensora incorporado con la molécula. antiSMASH 31,32,33 también muestra las agrupaciones similares de compuestos ya conocidos, con un enlace a la base de datos MIBiG 37. </li> Comparación de la estructura del compuesto con estos otros compuestos y comprobar si hay similitudes. Figura 4: Salida de antiSMASH Polyketomycin biosintética de Gene Cluster y visión general de otros clusters en S. diastatochromogenes Tü6028. (A) Descripción general de los grupos de genes biosintéticos predichos en el genoma de S. diastatochromogenes Tü6028; (B) Grupo 2 Polyketomycin agrupación de genes biosintéticos con determinados genes. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. 5. Verificación del cluster biosintético de Gene Búsqueda de un gen con funciones obvias e importantes (esenciales) para la biosíntesis del compuesto. Para la verificación de la polyketogrupo de genes micina la pokPI gen, que codifica para la α cetosintasa de la PKS de tipo II, se seleccionó y se inactiva por un fuera de -deletion marco (véase la figura 5B). Alternativamente, la interrupción del gen mediante la clonación de un fragmento interno (véase la Figura 5C). Figura 5: Verificación de una agrupación de genes mediante entrecruzamiento sencillo. (A) gen nativo conduce a la traducción de una proteína funcional; (B) Clonación del gen con deleción interna en un vector suicida conduce a un único cruce que resulta en un cambio de marco en el gen diana y la posterior traducción de la proteína no funcional; (C) Clonación de un fragmento interno del gen en un vector suicida conduce a un truncamiento del gen y la posterior traducción de una proteína no funcional. oriT: origen de tRANSFERENCIA; R antibióticos: resistencia a los antibióticos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Clonación del constructo de un solo cruce Amplificar un fragmento que contiene pokPI por PCR con los cebadores 38 y pokPI_for pokPI_rev. Producto Clone PCR en el vector suicidio pKC1132 39 (apramicina R [50 mg / ml]). El vector suicida no es capaz de replicarse en la cepa de Streptomyces y por lo tanto tiene que integrar en el gen diana mediante recombinación homóloga para proporcionar apramicina-resistencia. Transferir el vector en E. coli huésped de clonación mediante la transformación de choque térmico 40. Aislar el vector mediante lisis alcalina 41. Digerir el ADN del vector con una sola enzima de restricción de corte que corta dentro del fragmento. El gen pokPIe se digirió con enzima Kpn I. Tratar DNA vector digerido con el ADN grande de la polimerasa I (Klenow) fragmento, que tiene '→ 3' actividad 5 polimerasa y 3 '→ 5' exonucleasa-actividad. Blunting de los extremos cohesivos y religación posterior conduce a la pérdida de cuatro bases. Compruebe si hay pérdida de estas bases por la transformación pasos en E. coli XL1 Blue, recogiendo colonias individuales, aislar su ADN plásmido, 41 y analizar más a fondo por la digestión de restricción y secuenciación. Conjugación del cruce de un solo constructo en Streptomyces Transferir el vector suicida que contiene el gen pokPI (pKC1132_ pokPI DEL) con deleción en E. coli ET 12567 pUZ8002 42 (kanamicina R) por transformación de choque térmico 40. Se incuban las células en 100 ml de medio LB (kanamicina 50 mg ml -1, apramicina 50 mg ml -1 </sup>) Durante la noche a 37 ° C. células de la cosecha por centrifugación (3.000 xg, 10 min, 4 ° C) y lavar células dos veces por resuspensión en 50 ml de medio LB. Por último, volver a suspender las células en 2 x 500 l de medio LB. Mezclar 500 l E. coli pUZ8002 pKC1132_ pokPI con la cultura del 500 l Streptomyces diastatochromogenes (alternativamente usar esporas). Extender la mezcla en placas MS (harina de soja 20 g, D-manitol 20 g, MgCl2 10 mM, 1,5% de agar, el agua del grifo 1 l). Incubar las placas durante 20 horas a 28 ° C. Superponer cada placa con apramicina (1,25 mg) y fosfomicina (5 mg) disuelto en 1 ml de agua y dejar secar. Se incuban las placas durante varios días a 28 ° C hasta que exconjugantes son visibles. Compruebe mutantes entrecruzamiento sencillo Inocular exconjugantes individuales en 20 ml de medio TSB (apramicina 50 mg ml -1) y los incuban a 28 ° C durante tres días y 180 rpm. Aislar el ADN genómico 43 y comprobar la interrupción del gen pokPI por PCR. Se inoculan los clones individuales con la interrupción del gen de tipo salvaje cepa verificada y Streptomyces en 100 ml de medio de HA y los incuban durante 6 días a 28 ° C y 180 rpm. Se extrae el extracto crudo (ver sección 1.3). Verificar la producción de compuestos mediante análisis por HPLC-MS (ver sección 1.4). El pico correspondiente en el cromatograma de HPLC y la masa del compuesto no deberían ser detectables más (véase la Figura 6). Figura 6: Análisis por HPLC de S. diastatochromogenes con inactivada pokPI génica. Cromatograma HPLC (λ = 430 nm) del extracto crudo de S. diastatochromogenes WT (arriba) y la cepa mutante con interrumpido pokPI -Gén (abajo). La cepa mutante no produce polyketomycin más.Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.