D'un produit naturel à son cluster Gène biosynthétique: Une démonstration utilisant Polyketomycin de<em> Streptomyces diastatochromogenes</em> Tü6028

1. Identification d'un produit naturel avec des antibiotiques de la propriété Cultiver un micro – organisme dans des conditions différentes (par exemple le temps, la température, le pH, les médias) à la suite de la "OSMAC (une souche de nombreux composés) approche" 13. Sélectionner un milieu dans lequel la production d'un composé est observée. Cultiver Streptomyces Tü6028 dans les conditions suivantes Cultiver la souche Tü6026 de Streptomyces sur des plaques de sclérose en plaques (farine de soja 20 g, D-mannitol 20 g, MgCl2 10 mM, agar 1,5%, l' eau du robinet 1 L). Inoculer une petite boucle des spores de cette souche dans 20 ml de milieu TSB liquide (soja tryptique bouillon 30 g, l'eau du robinet 1 L, pH 7,2, milieu de préculture) dans une fiole Erlenmeyer avec une spirale. Agiter le flacon sur un agitateur rotatif (28 ° C, 180 rpm, 2 jours). Inoculer la culture principale dans un milieu HA 100 ml (4 g de glucose, extrait de levure 4 g de maltextrait 10 g, eau du robinet 1 litre, pH 7,2) avec 2 ml de la préculture. Culture de la souche à 28 ° C pendant 6 jours sur un agitateur rotatif à 180 tours par minute. Préparation de l'extrait brut Récolte des cellules par centrifugation (10 min, 3000 xg). Pour les prochaines étapes manipuler des solvants organiques sous une hotte. Pour l'extraction du composé à partir du mycélium, remettre les cellules dans un double volume d'acétone et agiter dans un tube pendant 30 min, 180 tours par minute. Filtrer le liquide à travers un papier filtre du commerce et on évapore l'acétone à l'évaporateur rotatif à 40 ° C et 550 bars. Dissoudre l'extrait dans 20 ml d'eau: acétate d'éthyle (1: 1) et l'agiter dans une ampoule à décanter pendant 30 min à 180 rpm. Pour l'extraction du composé à partir du milieu de culture, ajuster le bouillon de culture à pH 4,0 par addition de HCl 1 M. Ajouter de l'acétate d'éthyle 100 ml et l'agiter dans une ampoule à décanter pendant 30 min, 180 rpm. Recueillir la phase d'acétate d'éthyle et évaporer par la pourriture évaporation ary à 40 ° C et 240 bar. L' analyse de l'extrait brut par HPLC Dissoudre les extraits dans 1 ml de MeOH, filtrer à travers un filtre de taille de 0,45 um de pores et exécuter la chromatographie liquide à haute performance (CLHP) 14. Dans le cas de polyketomycin, d' équiper le système HPLC avec une précolonne C18 (4,6 x 20 mm 2) et une colonne C18 (4,6 x 100 mm 2). Utiliser un gradient linéaire d'acétonitrile + acide acétique à 0,5% allant de 20% à 95% en H (débit: 0,5 ml min -1) d'acide acétique 2 O + 0,5%. NOTE: Polyketomycin a un temps de rétention de 25,9 min (voir la figure 1A). Le spectre UV / vis présente des maxima à 242 nm, 282 nm, 446 nm et minima à 262 nm et 359 nm (voir figure 1B). Dans le mode négatif , une masse de 863,2 [MH] – est détectable (voir la figure 1C). "Src =" / files / ftp_upload / 54952 / 54952fig1.jpg "/> Figure 1: LC / MS Analyse des Polyketomycin. (A) Chromatogramme CLHP (λ = 430 nm) de l'extrait brut après la culture de Streptomyces Tü6028 pendant 6 jours. Polyketomycin a un temps de rétention de 25,9 min (B) , UV / vis des spectres de Polyketomycin. (C) Les spectres de masse de Polyketomycin dans le mode négatif. Pic principal avec m / z 863,2 [MH] -. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure. Identification de l'activité antibiotique utilisant un test de diffusion sur disque Inoculer souches d'essai comme subtilis bactéries Bacillus Gram positif (en milieu LB, LB 20 g, l' eau du robinet 1 L, pH 7,4) et d' autres souches de Streptomyces (en milieu TSB; bouillon de soja tryptique 30 g, l' eau du robinet 1 L, pH 70,2), les bactéries Gram-négatives Escherichia coli (dans du milieu LB) et des souches fongiques (dans des milieux tels que le milieu YPD, extrait de levure 10 g, 20 g de peptone, glucose 20 g, eau du robinet 1 litre, pH 7,4). Prendre 100 pi d'essai souche préculture et les répartir sur des plaques d'agar respectives. Dissoudre l'extrait brut ou composé purifié dans 500 pi de methanol (alternativement l'eau ou le DMSO) et pipette 20-50 pi sur des disques de papier stériles. disques de papier sec pour 30 min sous la table de travail et les mettre sur les plaques avec des cultures d'essai. Préparer un témoin négatif (solvant) et un contrôle positif (antibiotique, par exemple apramycine [1 mg]). Incuber les plaques dans des conditions adéquates jusqu'à ce que les souches d'essai sont visiblement cultivés et déterminer la zone d'inhibition, si apparente. Incuber E. coli et Bacillus sp. à 37 ° C pendant 16 h, Streptomyces sp. à 28 ° C pendant 2-4 jours, la souche fongique (principalement dépendante de la souche de test exact) unt 30 ° C pendant 2 jours). 2. Grande Extraction d'échelle, purification et structure Elucidation du composé Cultiver S. diastatochromogenes dans 5 L milieu de HA (glucose 4 g, extrait de levure 4 g, extrait de malt 10 g, eau du robinet 1 L, pH 7,2). Inoculer 2 ml de la préculture en 30 x 500 flacons Erlenmeyer ml contenant 150 ml milieu HA. Incuber la souche à 28 ° C pendant 6 jours sur un agitateur rotatif à 180 tours par minute. cellules de récolte par centrifugation (10 min, 15 000 xg, RT) et les composés d'extrait en utilisant l'acétate d'éthyle (voir section 1.3). Figure 2: Flux de travail pour la structure Elucidation. Le procédé comprend (1) la culture de la souche, (2) d'extraction, (3) la purification par extraction en phase solide (SPE), la Chromatographie sur couche mince (CCM), Chromatographie liquide haute performance preparative (HPLC), la tailleChromatographie d'exclusion (SEC) et (4) détermination de la structure par analyse de masse (MS), la résonance magnétique nucléaire (RMN) et des mesures radiographiques. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure. Purification de Polyketomycin Remarque: Le procédé de purification et la détermination de la structure est représentée sur la figure 2. Fractionner l' extrait brut par une colonne C18 extraction en phase solide (SPE) en utilisant un gradient de MeOH -stepwise 10% allant de 30% à 100% de MeOH dans H 2 O, 100 mL pour chaque condition. On purifie la fraction contenant le composé en outre par chromatographie préparative sur couche mince (CCM) en utilisant 15 CH 2 Cl 2 / MeOH (7: 1) comme système d'élution. Purifier le composé par HPLC préparative 16. Équiper le système HPLC avec une précolonne C18 (5 um, 9,4 x 20 mm) etcolonne principale (5 um, 9,4 x 150 mm). (Débit: 2,0 ml / min) en utilisant un gradient d'acétonitrile + acide acétique à 0,5% allant de 20% à 95% dans l' acide acétique H 2 O + 0,5%. Pour éliminer les solvants et d' autres petites impuretés, effectuer une dernière étape de purification par chromatographie d'exclusion stérique en utilisant une colonne 17 dans du MeOH. Recueillir le composé pur final et évaporer MeOH un évaporateur rotatif à 40 ° C et 240 bar. Structure elucidation On dissout le composé pur (plus de 2 mg) dans 600-700 ul (dépendant de la machine) de DMSO – d6, fiche 1D RMN (1 H, 13 C) et la RMN 2D (HSQC, HMBC, 1 H- 1 H COSY) les spectres sur un spectromètre de RMN 18. Exprimer les déplacements chimiques en valeurs ô (ppm) en utilisant DMSO – d6. Enregistrer un spectre de masse à haute résolution (HRESI-MS) 19 de polyketomycin utilisant une haute résolutionspectromètre de masse. Elucider la structure par l' interprétation des résultats de l' analyse des données RMN et MS 10. 3. Proposer biosynthétique Modèle du Nouveau composé isolé Analyser la structure du composé isolé et prévoir des enzymes qui pourraient être impliquées dans sa biosynthèse. Attribuer leur polycétide (type I, II ou III), la synthèse des peptides non-ribosomique, lantipeptide, terpénoïde, ou le sucre métabolisme voie 8. Exemple polyketomycin Subdiviser la structure en fractions simples évidentes: groupement tétracyclique, deux monosaccharides et l'acide salicylique de diméthyle. Savoir, où les fragments peuvent être obtenus à partir: Le fragment tétracyclique peut être dérivé d'un type polycétide synthase II et le fragment d'acide salicylique de diméthyle peut être dérivé d'un polycétide de type synthase itérative I. Les deux fragments de sucre, qui sont de 6 désoxysucres , pourrait être SYNTHESIzed à partir de glucose comportant un TDP-glucose-4,6-déshydratase lors biosynthèse et fixé probablement par deux glycosyltransférases (voir figure 3) 8. Prédire gènes putatifs dans le cluster. Penser à des enzymes qui sont impliquées dans la synthèse des fragments simples, en reliant les unités, ainsi que dans la modification et l'adaptation de la molécule. Le groupe de gènes biosynthétique de Polyketomycin contient très probablement des gènes codant pour un type polycétide synthase II (donc au moins un PVA, KS α und KS β pour le raccordement des unités d'extension), une méthode itérative de type polycétide synthase I (au moins ACP, AT, KS), un TDP-glucose-4,6-déshydratase (nécessaire pour l' étape: glucose → désoxyglucose) et deux glycosyltransférases (fixation de deux monomères de sucre vers l'aglycone) 8. Figure 3: Structure de Polyketomycin Divided en simples blocs de construction. Polyketomycin se compose d'un decaketid tétracyclique (PKS de type II) et d'un acide salicylique de diméthyle (itératif de type PKS I), reliés par les deux groupements désoxyose β-D-amicetose et α-L-axenose (PDN-glucose-4,6- déshydratase et deux glycosyltransférase requis). S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure. 4. Genome Sequencing / Mines Séquençage de nouvelle génération Séquencer l'ADN génomique par les technologies de séquençage de prochaine génération comme Illumina, 454 pyroséquençage ou SOLiD 20. Alignez seul lit à une séquence de référence ou d' assembler de novo. NOTE: Le génome de S. Tü6028 a été séquencée au Center for Biotechnology (CeBiTec) à l'Université de Bielefeld. Toutes les lectures ont été assemblés à un projet de génomede 7,9 Mb. L' exploitation minière du génome Rechercher des cadres de lecture ouverts (ORF) par l'utilisation de par exemple NCBI procaryotes Genome Annotation Pipeline 21,22, RAST (annotation rapide en utilisant la technologie du sous – système) 23,24,25, Prokka (rapide annotation du génome procaryote) 26 ou GenDB 27. Ces programmes proposent également leurs fonctions. L'analyse de la S. diastatochromogenes Tü6028 projet de séquençage du génome a conduit à l'identification de plus de 7000 ORFs. BLAST spécifique Run (Basic Local Alignment Search Tool) analyse pour obtenir plus d' informations , comme les alignements avec d' autres gènes similaires et domaines catalytiques 28,29,30. Pour l'identification des gènes de métabolite programmes cluster run secondaires comme antiSMASH 31,32,33, NaPDoS 34 et NRPSpredictor 35,36. Dans le projet de génome de antiSMASH 31,32,33 identi Streptomycesfiés 22 groupes de gènes. Analyser les groupes de gènes putatifs pour leur voie (s) enzymatique (polycétide synthase (type I, II ou III), synthétase non-ribosomique peptide, lanthipeptide, terpénoïdes, le métabolisme du sucre …). Recherche de groupe (s) contenant des gènes qui pourraient être impliqués dans la synthèse du composé (voir section 3). Dans S. diastatochromogenes groupe annotée 2 contient polycétide type synthase gènes II, trois gènes de polycétide de type synthase I, un gène TDP-glucose-4,6-déshydratase et deux gènes de glycosyltransférase (voir Figure 4). Focus sur des gènes uniques au sein du cluster. PKS pour le type I et NRPS la spécificité des acyltransférases et des domaines de adénylation, et donc l'incorporation d'unités d'extension unique, peut être prédite. Vous pouvez également comparer l'ordre de l'unité d'extension incorporé à la molécule. antiSMASH 31,32,33 montre également des grappes similaires de composés déjà connus, avec un lien vers la base de données MIBiG 37. </li> Comparer la structure du composé avec ces autres composés et vérifier les similitudes. Figure 4: Sortie antiSMASH de Polyketomycin biosynthétique Gene Cluster et vue d' ensemble des autres clusters dans S. diastatochromogenes Tü6028. (A) Vue d'ensemble des groupes de gènes biosynthétiques prédites dans le génome de S. diastatochromogenes Tü6028; (B) Cluster 2 groupe de gènes de biosynthèse Polyketomycin avec des gènes ciblés. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure. 5. Vérification du Cluster Gène biosynthétique Recherche d'un gène avec des fonctions évidentes et importantes (essentielles) pour la biosynthèse du composé. Pour la vérification de la polyketogroupe de gènes mycin le pokPI gène codant pour l'α de cétosynthase du type II PKS, a été sélectionné et inactivé par un hors du cadre -deletion (voir la figure 5B). Vous pouvez également interrompre le gène par clonage d' un fragment interne (voir la figure 5C). Figure 5: Vérification d'un groupe de gènes par simple Crossover. (A) gène natif conduit à la traduction d'une protéine fonctionnelle; (B) Clonage du gène par deletion interne dans un vecteur suicide conduit à un croisement entraîne un décalage de cadre dans le gène ciblé et la traduction subséquente de la protéine non fonctionnelle; (C) Clonage d'un fragment interne du gène dans un vecteur suicide conduit à une troncature du gène et la traduction subséquente d'une protéine non fonctionnelle. oriT: origine de transfert; antibiotique R: résistance aux antibiotiques. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure. Clonage de la construction simple croisement Amplifier un fragment contenant pokPI par PCR avec des amorces 38 pokPI_for et pokPI_rev. Produit Clone PCR dans le vecteur suicide pKC1132 39 (apramycine R [50 mg / mL]). Le vecteur de suicide ne sont pas capables de se répliquer dans la souche Streptomyces et a donc à intégrer dans le gène ciblé par recombinaison homologue pour fournir apramycine-résistance. Transférer le vecteur dans E. coli hôte de clonage par le choc transformation de chaleur 40. Isoler le vecteur par lyse alcaline 41. Digérer l'ADN vecteur avec une seule enzyme de restriction de coupe qui coupe à l'intérieur du fragment. Le pokPI genE a été digéré par enzyme Kpn I. Traiter l'ADN du vecteur digéré avec grande ADN polymerase I (Klenow) fragment, ce qui a 5 '→ 3' activité de polymerase et 3 '→ 5' exonucléase activité. Désaffûtant des extrémités collantes et religation subséquente conduit à la perte de quatre bases. Vérifier la perte de ces bases par la transformation des étapes dans E. coli XL1 Blue prélèvement de colonies individuelles, à isoler leur ADN plasmidique, 41 et en outre l' analyse par digestion de restriction et séquençage. Conjugaison du simple croisement construire dans Streptomyces Transférer le vecteur suicide contenant le gène pokPI (pKC1132_ pokPI del) avec suppression dans E. coli ET12567 pUZ8002 42 (kanamycine R) par le choc de transformation de chaleur 40. Incuber les cellules dans 100 ml LB médias (kanamycine 50 ug mL -1, apramycine 50 pg ml -1 </sup>) Pendant la nuit à 37 ° C. récolte des cellules par centrifugation (3000 xg, 10 min, 4 ° C) et laver les cellules deux fois par remise en suspension dans 50 ml de milieu LB. Enfin, remettre les cellules dans 2 x 500 ul de milieu LB. Mélanger 500 ul E. coli pUZ8002 pKC1132_ pokPI del avec la culture de 500 ul Streptomyces (alternativement utiliser des spores). Étendre le mélange sur des plaques MS (farine de soja 20 g, D-mannitol 20 g, MgCl2 10 mM, agar 1,5%, l' eau du robinet 1 L). Incuber les plaques pendant 20 h à 28 ° C. Superposez chaque plaque avec apramycine (1,25 mg) et fosfomycine (5 mg) dissous dans 1 ml d'eau et les laisser sécher. Laisser incuber les plaques pendant plusieurs jours à 28 ° C jusqu'à ce que exconjuguants sont visibles. Vérifiez mutants crossovers simples Inoculer exconjugants unique dans 20 mL du milieu TSB (apramycine 50 mg mL -1) et les incuber à 28 ° C pendant trois jours et 180 tours par minute. Isoler l' ADN génomique 43 et vérifier l' interruption du gène pokPI par PCR. Inoculer clones individuels avec interruption génique vérifiée et Streptomyces souche de type sauvage dans 100 ml milieu HA et incuber pendant 6 jours à 28 ° C et 180 rpm. Extraire l'extrait brut (voir section 1.3). Vérifiez la production de composé par analyse HPLC-MS (voir section 1.4). Le pic correspondant dans le chromatogramme HPLC et la masse du composé ne devrait pas être plus détectable (voir Figure 6). Figure 6: Analyse par HPLC de S. diastatochromogenes avec inactivé pokPI Gene. HPLC chromatogramme (λ = 430 nm) d'extrait brut de S. diastatochromogenes WT ( en haut) et de la souche mutante avec interrompue pokPI -Gen (ci – dessous). La souche mutante ne produit plus polyketomycin.S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.