A partir de um produto natural para seu cluster de genes biossintéticos: Uma demonstração utilizando Polyketomycin de<em> Streptomyces diastatochromogenes</em> Tü6028

1. Identificação de um produto natural com Antibiótico Property Cultivar um microorganismo sob diferentes condições (por exemplo, tempo, temperatura, pH, media) na sequência da "abordagem OSMAC (uma estirpe de muitos compostos)" 13. Seleccionar um meio em que se observa a produção de um composto. Cultive Streptomyces diastatochromogenes Tü6028 sob as seguintes condições Cresça Streptomyces diastatochromogenes Tü6026 estirpe em placas MS (farinha de soja 20 g, de D-manitol 20 g, MgCl 2 10 mM, 1,5% de agar, água da torneira 1 L). Inocular um pequeno laço dos esporos desta estirpe em 20 ml de meio TSB líquido (soja tríptico caldo de 30 g, a água da torneira 1 L, pH 7,2; meio de pré-cultura) em uma garrafa de Erlenmeyer com uma espiral. Agitar o frasco num agitador rotativo (28 ° C, 180 rpm, 2 dias). Inocular cultura principal, em 100 mL de meio HA (glucose 4 g, extrato de levedura 4 g, malteextrair 10 g, água da torneira 1 L, pH 7,2) com 2 mL de pré-cultura. Cultura da estirpe a 28 ° C durante 6 dias num agitador rotativo a 180 rpm. Preparação do extracto bruto Células colheita por centrifugação (10 min, 3000 xg). Para os próximos passos lidar com solventes orgânicos sob uma coifa. Para a extracção composto a partir do micélio, Ressuspender as células em um duplo volume de acetona e agitar num tubo durante 30 min, 180 rpm. Filtra-se o líquido através de papel de filtro comercial e evapora-se a acetona num evaporador rotativo a 40 ° C e 550 bar. Dissolve-se o extracto em 20 ml de água: acetato de etilo (1: 1) e agitá-lo em uma ampola de decantação de 30 min a 180 rpm. Para a extracção do composto do meio de cultura, ajustar o caldo de cultura a pH 4,0 por adição de HCl 1M. Adicionar 100 mL de acetato de etilo e agitá-lo em uma ampola de decantação de 30 min, 180 rpm. Recolha fase de acetato de etilo e evaporar pela podridão Ary evaporação a 40 ° C e 240 bar. A análise do extracto em bruto por HPLC Dissolve-se os extractos em 1 mL de MeOH, filtrá-los através de um filtro de tamanho de poro de 0,45 um e executar a cromatografia líquida de alto desempenho (HPLC) 14. No caso de polyketomycin, equipar o sistema de HPLC com uma pré-coluna C18 (4,6 x 20 mm 2) e uma coluna C18 (4,6 x 100 mm 2). Usar um gradiente linear de acetonitrilo + 0,5% de ácido acético que vão desde 20% a 95% em H 2 O + 0,5% (caudal: 0,5 mL min -1) de ácido acético. NOTA: Polyketomycin tem um tempo de retenção de 25,9 min (ver Figura 1A). O espectro de UV / VIS tem máximos a 242 nm, 282 nm, 446 nm e mínimos a 262 nm e 359 nm (ver Figura 1B). No modus negativo uma massa de 863,2 [MH] – é detectável (ver Figura 1C). "Src =" / files / ftp_upload / 54952 / 54952fig1.jpg "/> Figura 1: LC / MS Análise de Polyketomycin. (A) Cromatograma de CLER (λ = 430 nm) do extracto em bruto depois de cultivo de Streptomyces diastatochromogenes Tü6028 durante 6 dias. Polyketomycin tem um tempo de retenção de 25,9 min, (B) de UV / VIS espectros de Polyketomycin. (C) Os espectros de massa de Polyketomycin no modus negativo. Pico principal com m / z 863,2 [MH] -. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Identificação da actividade antibiótica utilizando o ensaio de difusão em disco Inocular estirpes de teste como bactérias Bacillus subtilis Gram-positivos (em meio LB; LB 20 g, água da torneira 1 L, pH 7,4) e outras estirpes de Streptomyces (em meio TSB; tryptic soy broth 30 g, água da torneira 1 L, pH 70,2), bactérias Gram-negativas de Escherichia coli (em meio LB) e estirpes de fungos (tais como em meios de meio YPD; extracto de levedura 10 g, 20 g de peptona, 20 g de glucose, água da torneira 1 L, pH 7,4). Tome 100 mL de teste de tensão pré-cultura e espalhá-los sobre as respectivas placas de ágar. Dissolve-se o extracto em bruto ou purificado de composto 500 ul de metanol (alternativamente água ou DMSO) e pipeta de 20-50 uL em discos de papel estéreis. discos de papel seco para 30 min sob a bancada de trabalho e colocá-los sobre as placas com culturas de ensaio. Preparar um controlo negativo (solvente) e um controlo positivo (antibiótico, por exemplo, apramicina [1 mg]). Incubam-se as placas sob condições adequadas até que as estirpes de ensaio são cultivadas visivelmente e determinar a zona de inibição, se aparente. Incubar E. coli e Bacillus sp. a 37 ° C durante 16 h, Streptomyces sp. a 28 ° C durante 2-4 dias, a estirpe de fungos (principalmente dependente estirpe de ensaio exato) umt 30 ° C durante 2 dias). 2. Grande Extração Scale, purificação e elucidação da estrutura do Composto Cultivar S. diastatochromogenes em 5 L de meio de HA (glucose 4 g, extracto de levedura 4 g, extracto de malte, 10 g, a água da torneira 1 L, pH 7,2). Inocular 2 ml da pré-cultura em frascos de 30 x 500 ml de Erlenmeyer contendo 150 ml de meio de HA. Incubar a estirpe a 28 ° C durante 6 dias num agitador rotativo a 180 rpm. Células colheita por centrifugação (10 min, 15.000 xg, RT) e extrair compostos utilizando acetato de etilo (ver secção 1.3). Figura 2: Fluxo de trabalho para elucidação da estrutura. O processo compreende (1) o cultivo da estirpe, (2) de extracção, (3) purificação por extracção em fase sólida (SPE), cromatografia em camada fina (TLC), cromatografia líquida de alta eficiência preparativa (HPLC), tamanhocromatografia de exclusão (SEC) e (4) elucidação da estrutura por análise de massa (MS), de ressonância magnética nuclear (RMN) e as medições de raios-X. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura. A purificação do Polyketomycin NOTA: O processo de purificação e elucidação da estrutura é mostrada na Figura 2. Fraccionar extracto em bruto através de uma coluna C18 de extracção em fase sólida (SPE), utilizando um gradiente de MeOH 10% -stepwise variando de 30% a 100% de MeOH em H2O, 100 mL para cada condição. Purifica-se a fracção contendo o composto ainda por cromatografia em camada fina preparativa (TLC) usando 15 CH 2 Cl 2 / MeOH (7: 1) como sistema de eluição. Purifica-se o composto 16 por HPLC preparativa. Equipar o sistema de HPLC com uma pré-coluna C18 (5 m; 9,4 x 20 mm) e umcoluna principal (5 | iM; 9,4 x 150 mm). Usar um gradiente de ácido acético acetonitrilo + 0,5% variando de 20% a 95% em H 2 O + 0,5% de ácido acético (taxa de fluxo: 2,0 mL / min). Para remover os solventes e outras pequenas impurezas, efectuar um último passo de purificação por cromatografia de exclusão de tamanho utilizando uma coluna de 17 em MeOH. Recolhe-se o composto puro final e evapora-se de MeOH por evaporação rotativa a 40 ° C e 240 bar. elucidação estrutural Dissolve-se o composto puro (mais do que 2 mg) em 600-700 ul (dependente da máquina) de DMSO-d 6, ficha 1E RMN (1 H, 13 C) e RMN 2D (HSQC, HMBC, 1 H- 1 H COSY) espectros em um espectrômetro de RMN 18. Expresso de desvios químicos em valores de ô (ppm) usando DMSO-d 6. Grave um espectro de massa de alta resolução (HRESI-MS) 19 de polyketomycin usando uma alta resoluçãoespectrômetro de massa. Elucidar a estrutura de interpretação dos resultados da análise dos dados de RMN e MS 10. 3. Propor biossintética modelo do novo composto isolado Analisar a estrutura do composto isolado e prever enzimas, que podem estar envolvidos na sua biossíntese. Atribuí-los a policetido (tipo I, II ou III), a síntese de péptidos não-ribossomal, lantipeptide, terpenóides, ou açúcar via do metabolismo 8. exemplo polyketomycin Subdividir a estrutura em óbvias porções individuais: porção tetrac�lico, dois monossacarídeos e do ácido salicílico dimetil. Descobre, em que os fragmentos possam ser derivados a partir de: A porção tetracíclico podem ser derivados a partir de um tipo de policetido-sintase II e a parte de ácido salicílico de dimetilo pode ser derivado por uma policetido-sintase iterativo tipo I. As duas metades de açúcar, os quais são 6-deoxysugars , pode ser synthesizada a partir de glucose, envolvendo uma TDP-glicose-4,6-desidratase durante a biossíntese e provavelmente ligado por dois glicosiltransferases (ver Figura 3) 8. Prever genes putativos no cluster. Pense de enzimas que estão envolvidos na síntese das porções individuais, em que liga as unidades, bem como na alteração e adaptação da molécula. O cluster de genes biossintéticos de Polyketomycin provavelmente contém genes que codificam um tipo policetídeo sintase II (portanto mínimo um ACP, KS α und KS β para conectar unidades de diluição), um iterativo tipo policetídeo sintase I (pelo menos ACP, AT, KS), um TDP-glucose-4,6-desidratase (necessário para a etapa: glucose → deoxiglicose) e dois glicosiltransferases (anexar dois monómeros de açúcar para a aglicona) 8. Figura 3: Estrutura de Polyketomycin Divided em single Building Blocks. Polyketomycin é composto de um decaketid tetracíclico (PKS tipo II) e um ácido salicílico dimetil (iterativo de PKS tipo I), ligadas por duas porções deoxysugar β-D-amicetose e α-L-axenose (NDP-glicose-4,6- desidratase e dois glicosiltransferase necessária). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura. 4. Genome Sequencing / Mineração Sequenciamento de próxima geração Sequenciar o DNA genômico por tecnologias de sequenciamento de próxima geração como Illumina, 454 pyrosequencing ou sólida 20. Alinhar única lê a uma sequência de referência ou montar de novo. NOTA: O genoma de S. diastatochromogenes Tü6028 foi sequenciado no Centro de Biotecnologia (CeBiTec) na Universidade de Bielefeld. Todas as leituras foram montados com um projecto de genomade 7,9 Mb. mineração genoma Busca de quadros de leitura aberta (ORF) pela utilização de, por exemplo NCBI Procarióticas Genome Anotação Pipeline 21,22, RAST (anotação rápida usando a tecnologia do subsistema) 23,24,25, Prokka (rápida anotação do genoma procariotas) 26 ou GenDB 27. Estes programas também propor suas funções. A análise da sequência de S. diastatochromogenes Tü6028 projecto de genoma levou à identificação de mais de 7.000 ORFs. Execute BLAST específico (Básico Local Alignment Search Tool) Análise para obter mais informações como alinhamentos com outros genes semelhantes e domínios catalíticos 28,29,30. Para a identificação dos programas gene cluster executar metabolito secundário como antiSMASH 31,32,33, 34 e NaPDoS NRPSpredictor 35,36. No projecto de genoma de Streptomyces diastatochromogenes antiSMASH 31,32,33 identicadas 22 agrupamentos de genes. Analisar os agrupamentos de genes putativos para a sua via enzimática (s) (de policetido-sintase (tipo I, II ou III), sintetase não-péptido ribossomal, lanthipeptide, terpenóides, metabolismo do açúcar …). Pesquisa para agrupar (s) contendo os genes que possam estar envolvidos na síntese do composto (ver secção 3). Em S. diastatochromogenes de cluster anotada 2 contém genes II, eu genes de três policetídeo tipo sintase, um gene-TDP-glucose 4,6-desidratase e dois genes de glicosiltransferase (ver Figura 4) policetídeo tipo sintase. Concentre-se em genes individuais dentro do cluster. Para o tipo I e PKS NRPS a especificidade de aciltransferases e domínios adenilação, e, assim, a incorporação de unidades individuais de diluição, pode ser previsto. Também comparar a ordem da unidade de extensor incorporado com a molécula. antiSMASH 31,32,33 também mostra aglomerados semelhantes de compostos já conhecidos, com uma ligação à base de dados MIBiG 37. </li> Comparar a estrutura do composto com estes compostos e verificar se há semelhanças. Figura 4: Saída antiSMASH de Polyketomycin biossintética Gene Cluster e Visão Geral de Outros Clusters em S. diastatochromogenes Tü6028. (A) Resumo dos agrupamentos de genes biossintéticos previstos no genoma de S. diastatochromogenes Tü6028; Conjunto de genes biossintéticos (B) Cluster 2 Polyketomycin com genes alvo. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura. 5. A verificação do Cluster de genes biossintéticos Procurar um gene com funções importantes e óbvias (essenciais) para a biosíntese do composto. Para verificação da polyketoo aglomerado de genes micina pokPI gene, que codifica para a α ketosynthase da PKS tipo II, foi seleccionado e inactivado por uma fora de enquadramento -deletion (ver Figura 5B). Em alternativa, interrompe o gene através da clonagem de um fragmento interno (ver Figura 5C). Figura 5: Verificação de um Cluster Gene pelo único Crossover. (A) do gene nativo conduz à tradução de uma proteína funcional; (B) Clonagem do gene com deleção interna num vector suicida leva a um único cruzamento, resultando em um desvio de enquadramento no gene alvo e subsequente tradução de proteínas de não-funcional; (C) Clonagem de um fragmento interno do gene num vector suicida leva a uma truncagem do gene e a subsequente tradução de uma proteína não funcional. oriT: origem da transferência; R antibiótico: resistência a antibióticos. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Clonagem do construto-único cruzamento Amplificar um fragmento contendo pokPI por PCR 38 com primers pokPI_for e pokPI_rev. Clone produto de PCR no vector suicida pKC1132 39 (apramicina R [50 mg / mL]). O vector suicida não é capaz de se replicar na estirpe de Streptomyces e, assim, tem de se integrar no gene alvo pela recombinação homóloga para fornecer apramicina-resistência. Transferir o vector em E. coli hospedeiro de clonagem por transformação de choque térmico 40. Isolar o vector por lise alcalina 41. Digerir o ADN do vector com uma única enzima de restrição de corte que corta dentro do fragmento. O pokPI gene foi digerido com enzima Kpn I. Tratar ADN do vector digerido com grande de polimerase I de ADN (Klenow) de fragmento, o qual tem 5 '→ 3' e a actividade da polimerase '→ 5' exonuclease 3-actividade. Embotamento das extremidades coesivas e religação subsequente conduz à perda de quatro bases. Verifique se há perda destas bases de transformação etapas em E. coli XL1 azul, pegando colónias isoladas, isolando seu DNA de plasmídeo, 41 e aprofundar a análise por digestão de restrição e sequenciação. Conjugação do single-cruzado construir em Streptomyces Transferir o vector suicida contendo o gene pokPI (pKC1132_ pokPI del) com supressão em E. coli ET12567 pUZ8002 42 (canamicina R) por transformação de choque térmico 40. Incubar as células em 100 ml de meios LB (canamicina 50 ug mL-1, apramicina 50 ug mL-1 </sup>) Durante a noite a 37 ° C. Células colheita por centrifugação (3000 xg, 10 min, 4 ° C) e lavar as células duas vezes por ressuspensão em 50 mL de meios LB. Finalmente, Ressuspender as células em 2 x 500 mL de meio LB. Misturar 500 mL de E. coli pUZ8002 pKC1132_ pokPI del com 500 pL de cultura de Streptomyces diastatochromogenes (alternativamente usar esporos). Espalhar a mistura sobre placas de MS (farinha de soja 20 g, de D-manitol 20 g, MgCl 2 10 mM, 1,5% de agar, água da torneira 1 L). Incubar as placas durante 20 h a 28 ° C. Overlay cada placa com apramicina (1,25 mg) e fosfomicina (5 mg) dissolvido em 1 ml de água e deixar secar. Incubar as placas durante vários dias a 28 ° C até que os exconjugantes são visíveis. Verifique mutantes de crossover único Inocular exconjugantes individuais em 20 ml de meio TSB (apramicina 50 mg mL -1) e incubar a 28 ° C durante três dias e 180 rpm. Isolar DNA genômico 43 e verifique interrupção do gene pokPI por PCR. Inocular os clones individuais com a interrupção do gene verificada e a estirpe Streptomyces tipo selvagem, em 100 mL de meio de HA e incubar durante 6 dias a 28 ° C e 180 rpm. Extrair o extrato bruto (ver secção 1.3). Verifique produção composto por análise de HPLC-MS (ver secção 1.4). O pico correspondente no cromatograma de HPLC e a massa do composto não deve ser detectada mais (ver Figura 6). Figura 6: Análise por HPLC da S. diastatochromogenes com pokPI gene inactivado. Cromatograma de HPLC (λ = 430 nm) de extracto em bruto de S. diastatochromogenes WT (topo) e a estirpe mutante com interrompida pokPI -Gen (abaixo). A estirpe mutante não produz mais polyketomycin.Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.