からPolyketomycinを使用したデモンストレーション：天然物からの生合成遺伝子クラスターへ<em>ストレプトミセスdiastatochromogenes</em>Tü6028

抗生物質プロパティを持つ天然物の1識別 「OSMAC（1株-多くの化合物）アプローチ」13以下の異なる条件（ 例えば、時間、温度、pH、メディア）の下で微生物を養います。化合物の産生が観察されたものでメディアを選択します。 以下の条件でストレプトミセスdiastatochromogenesTü6028の育成 MSプレート上のストレプトミセスdiastatochromogenesTü6026株成長（大豆粉を20グラム、D-マンニトール20グラム、のMgCl 2 10mMの、1.5％寒天、水道水1 L）。スパイラルとの三角フラスコ中の、小さな20mLの液体TSB培地にこの株の胞子のループ（前培養培地トリプシン大豆培養液30グラム、水道水1リットル、pHは7.2）を接種します。ロータリーシェーカー（28℃、180 rpmで、2日）にフラスコを振ります。 100 mLのHA培地で本培養を接種（グルコース4 gの酵母エキス4 gの麦芽前培養の2 mLで10グラム、水道水1リットル、pHは7.2）を抽出。文化180 rpmでロータリーシェーカー上で6日間28℃で歪み。 粗抽出物の調製 遠心分離により細胞を回収し（10分、3,000×gで）。 次の手順については、ヒュームフードの下で有機溶剤を扱います。 菌糸体からの化合物の抽出のために、アセトンの二倍の体積で細胞を再懸濁し、30分間、180 rpmでのためにチューブに振ります。商業用ろ紙を通過する液体を濾過し、40℃、550バールで、ロータリーエバポレーターでアセトンを蒸発させます。 20 mLの水で抽出物を溶解：酢酸エチル（1：1）、180rpmで30分間分液漏斗中で振っ。 培地から化合物を抽出するため、1 M HClの添加によりpHを4.0に培養液を調整します。 100 mLの酢酸エチルを加え、30分、180 rpmでのための分液漏斗にそれを振ります。 酢酸エチル相を収集し、腐敗によって蒸発 40℃、240バールで進蒸発。 HPLCによる粗抽出物の分析 1mLのMeOH中の抽出物を溶解し、0.45μmの孔サイズのフィルターを介してそれらをフィルタリングし、高速液体クロマトグラフィー（HPLC）14を実行します 。 polyketomycinの場合には、C18プレカラム（4.6×20 mm 2）とし、C18カラム（4.6×100 mm 2）とを備えたHPLCシステムを装備。 H中の20％から95％までのアセトニトリル+ 0.5％酢酸の直線勾配を使用して2 O + 0.5％酢酸（流速：0.5 mLの分-1）。 注：Polyketomycinは25.9分の保持時間を有している（ 図1Aを参照）。 UV /可視スペクトルは、262 nmおよび359 nmで242 nmで、282 nmの、446 nmおよび最小値で最大値を有している（ 図1B参照）。負の手口863.2 [MH]の質量に- （ 図1Cを参照）検出可能です。 "SRC =" /ファイル/ ftp_upload / 54952 / 54952fig1.jpg "/> 図1：PolyketomycinのLC / MS分析。 6日間ストレプトミセスdiastatochromogenesTü6028の培養後の粗抽出物の（A）のHPLCクロマトグラム（λ= 430 nm）を。 Polyketomycinは/ VisスペクトルPolyketomycinの25.9分（B）UVの保持時間を有します。 （C）負の様式でPolyketomycinの質量スペクトル。 m / z 863.2 [MH]でメインピーク- 。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。 ディスク拡散アッセイを使用して抗生物質活性の同定 グラム陽性細菌の枯草菌のような試験菌株を接種（LB培地中で、LB 20 gの水道水1リットル、pH7.4）で、およびTSB培地中の他のストレプトマイセス株（;トリプシン大豆ブロス30 gの水道水1 L、pHが7.2）、グラム陰性菌をLB培地中で大腸菌 （）および真菌株（例えば、YPD培地などの培地中で、酵母エキス10 gのペプトン20 gのグルコース20 gの水道水1リットル、pH7.4中）。試験株の前培養の100μLを取り、それぞれの寒天プレート上にそれらを広げました。 滅菌ペーパーディスク上にメタノール（あるいは水またはDMSO）およびピペット20-50μLの500μL中の粗抽出物または精製された化合物を溶解させます。ワークベンチの下で30分間乾燥したペーパーディスクおよび試験培養物とのプレート上にそれらを置きます。陰性対照（溶媒）および陽性対照を準備し（抗生物質、 例えばアプラマイシン[1ミリグラム]）。 試験株が目に見えて成長されるまで、適切な条件下で培養すると、見かけの場合、阻害ゾーンを決定します。 大腸菌及びバチルスをインキュベートします。 16時間、37℃、 ストレプトミセス種で。 2-4日間28℃で、真菌株（正確な試験株に主に依存）AT 2日間30℃で）。 2.大規模抽出、精製及び化合物の構造解明 5 L HA培地中のS. diastatochromogenesを育成（グルコース4グラム、酵母エキス4グラム、麦芽エキス10グラム、水1リットル、pH7.2のをタップします）。 150 mLのHA培地を含む30×500 mLの三角フラスコ中の予備培養の2ミリリットルを接種します。 180 rpmでロータリーシェーカー上で6日間、28℃で歪みをインキュベートします。 酢酸エチルを用いて、遠心分離（10分、15,000×gで、RT）と抽出化合物による収穫細胞（セクション1.3を参照）。 図2：構造解析のワークフロー。プロセス含む固相抽出（SPE）によって（1）菌株の培養、（2）抽出、（3）精製、薄層クロマトグラフィー（TLC）、分取高速液体クロマトグラフィー（HPLC）、サイズ質量分析（MS）、核磁気共鳴（NMR）およびX線測定によって排除クロマトグラフィー（SEC）及び（4）の構造解明。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。 Polyketomycinの精製 注：精製および構造解明の過程は、図2に示されています。 mLを各条件について100、H 2 O中の30％から100％のMeOHまでの範囲の10％-stepwise MeOH勾配を用いたC18固相抽出（SPE）カラムにより、粗抽出物を分画します。 溶出系として：（1 7） の CH 2 Cl 2 /メタノールを用いて分取薄層クロマトグラフィー（TLC）15によりさらに化合物を含有する画分を精製します。 分取HPLC 16によって化合物を精製します。そして、C18プレカラム（9.4 X 20ミリメートル5μm）を用いたHPLCシステムを装備メインカラム（5ミクロン、9.4×150 mm）です。 H中の20％から95％まで2 O + 0.5％酢酸の範囲のアセトニトリル+ 0.5％酢酸の勾配を使用し（流速：2.0 ml /分）。 溶媒および他の小さな不純物を除去し、MeOHを17カラムを用いたサイズ排除クロマトグラフィーによる最終精製工程を行います。最終的に純粋な化合物を収集し、40℃、240バールで回転蒸発によりメタノールを蒸発させます。 構造解明 DMSO-dの6の（マシン依存）600-700μLで純粋な化合物（以上2 mg）を、記録1D NMR（1 H、13 C）、および2D NMR（HSQC、HMBC、1 H- 1 Hを溶かしますNMR分光計18にCOSY）スペクトル。 DMSO-dの6を使用してδ値（ppm）で、化学シフトを表現します。 高解像度を使用して高分解能マススペクトル（HRESI-MS）polyketomycin 19を記録します質量分析計。 NMR及びMSデータ解析10の結果を解釈することにより構造を解明します。 3.新規単離された化合物の生合成モデルを提案します単離された化合物の構造を分析し、その生合成に関与している可能性がある酵素を、予測します。ポリケチド（タイプI、IIまたはIII）、非リボソームペプチド合成、lantipeptide、テルペノイド、又は糖代謝経路8に割り当てます。 例polyketomycin 四環部分、2単糖およびジメチルサリチル酸：明らかな単一の部分に構造を細分化。 四環部分ポリケチド合成酵素II型から派生している可能性があり、ジメチルサリチル酸部分は、反復ポリケチド合成酵素I型によって6 – デオキシ糖である2糖部分を、導出されることがあります。部分が由来する可能性がある場合には、見つけます、synthesiかもしれません生合成中にTDP-グルコース-4,6-デヒドラターゼを含むグルコースからZEDと2のグリコシルトランスフェラーゼによって、おそらく添付（ 図3を参照）8。 クラスタ内の推定遺伝子を予測します。ユニットを接続する際に、同様に変更し、分子を調整するには、単一成分の合成に関与する酵素を考えます。 Polyketomycinの生合成遺伝子クラスターは、おそらく（エクステンダーユニットを接続するため、したがって、最小ACP、KSαウントKSβ）ポリケチド合成酵素II型をコードする遺伝子を、含まれている反復ポリケチド合成酵素I型（少なくともACP、AT、KS）、 TDP-グルコース-4,6-デヒドラターゼ（ステップのために必要なグルコース→デオキシグルコース）と2つのグリコシルトランスフェラーゼ（アグリコンへの2つの糖モノマーを取り付ける）8。 図3：Polyketomycin divIdはの構造シングル・ビルディング・ブロックの中に編。 Polyketomycinは、β-D-amicetoseおよびα-L-axenose（NDP-グルコース-4,6- 2デオキシ糖部分によってリンクされ、四環decaketid（PKS II型）とジメチルサリチル酸（反復PKS I型）で構成されていますデヒドラターゼ及び必要な2つのグリコシルトランスフェラーゼ）。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。 4.ゲノムシーケンシング/マイニング 次世代シーケンシング イルミナ、454パイロシーケンシングまたは固体20のような次世代シーケンシング技術によるゲノムDNAの配列を決定。単一揃え参照配列に読み取りまたはデノボ組み立てます。 注：S. diastatochromogenesTü6028のゲノムはビーレフェルト大学バイオテクノロジーセンター（CeBiTec）で配列決定しました。すべてはドラフトゲノムに組み立てた読み込み7.9 Mbのの。 ゲノムマイニング 例えばNCBI原核生物ゲノム注釈パイプライン21,22のため、RAST（サブシステムテクノロジを使用して迅速な注釈）23,24,25、Prokka（急速な原核生物のゲノムアノテーション）26またはGenDB 27の使用によって、オープンリーディングフレーム（ORF）を検索します。これらのプログラムはまた、それらの機能を提案します。 S. diastatochromogenesTü6028のドラフトゲノム配列の分析は、7,000人以上のORFの同定につながりました。 他の類似の遺伝子および触媒ドメイン28,29,30とのアラインメントなどのようなより多くの情報を得るために特定のBLAST（基本的なローカル配列検索ツール）解析を実行します。 antiSMASH 31,32,33、NaPDoS 34とNRPSpredictor 35,36のような二次代謝遺伝子クラスターの実行プログラムの同定のため。 ストレプトミセスdiastatochromogenes antiSMASH 31,32,33同定のドラフトゲノム中22遺伝子クラスターをfiedが。 それらの酵素経路（複数可）（ポリケチド合成酵素（タイプI、IIまたはIII）、非リボソームペプチド合成酵素、lanthipeptide、テルペノイド、糖代謝…）のための推定遺伝子クラスターを分析します。化合物の合成に関与している可能性がある遺伝子を含むクラスター（複数可）を検索する（セクション3を参照）。 S.のdiastatochromogenesで注釈付きクラスター2は、ポリケチド合成酵素II型遺伝子、3ポリケチドシンターゼI型遺伝子、TDP-グルコース-4,6-デヒドラターゼ遺伝子と2糖転移酵素遺伝子を（ 図4を参照）が含まれています。 クラスタ内の単一の遺伝子に焦点を当てています。 PKS I型およびNRPSアシルトランスフェラーゼ及びアデニル化ドメインの特異性、及び従って単一エクステンダー単位の取り込みのために、予測することができます。また、分子と組み込まれた拡張装置ユニットの順序を比較します。 antiSMASH 31,32,33も MIBiGデータベース37へのリンクを、すでに知られている化合物の類似のクラスタを示しています。 </li> これらの他の化合物と化合物の構造を比較し、類似点を確認してください。 図4：S. diastatochromogenesTü6028で他のクラスタのPolyketomycin生合成遺伝子クラスターと概要のantiSMASH出力。 （A）は Sのゲノムにおける予測生合成遺伝子クラスターの概要Tü6028はdiastatochromogenes。標的遺伝子と（B）クラスタ2 Polyketomycin生合成遺伝子クラスター。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。 生合成遺伝子クラスターの5検証化合物の生合成のための明白かつ重要な（必須の）機能を持つ遺伝子を検索します。 polyketoの検証のためPKS II型からのケトシンターゼαをコードする遺伝子pokPIマイシン遺伝子クラスターは、 フレーム -deletion のうち （ 図5Bを参照）によって選択され、不活性化しました。また、内部断片をクローニングすることによって遺伝子を中断し（ 図5Cを参照してください）。 図5：シングルクロスオーバーによる遺伝子クラスターの検証。 （A）天然遺伝子は、機能的タンパク質の翻訳につながります。自殺ベクターに内部欠失を有する（B）遺伝子のクローニングは、標的遺伝子と非機能性タンパク質のその後の翻訳におけるフレームシフトをもたらす単一のクロスオーバーをもたらします。自殺ベクターへの遺伝子の内部断片の（C）のクローニング遺伝子および非機能的なタンパク質のその後の翻訳の切断をもたらします。 oriT：トンの起源ransfer。抗生R：抗生物質耐性。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。 シングルクロスオーバー構築物のクローニング プライマーpokPI_forとpokPI_revでPCR 38によってpokPIを含む断片を増幅します。 自殺ベクターへのクローンのPCR産物は、pKC1132 39（Rアプラマイシン[50 mg / mlで]）。自殺ベクターは、 ストレプトミセス株において複製することができないので、アプラマイシン抵抗性を提供するために、相同組換えにより標的遺伝子に統合しなければなりません。熱ショック変換40によってクローニング宿主大腸菌にベクトルを転送します。 アルカリ溶解41によってベクトルを分離します。 フラグメント内で切断する単一のカッター制限酵素でベクターDNAを消化。 pokPI GENeを用いて消化しました。 酵素のKpn I. 5 '→3'ポリメラーゼ活性および3 '→5'エキソヌクレアーゼ活性を有する大規模なDNAポリメラーゼI（クレノウ）フラグメント、で消化されたベクターDNAを扱います。粘着末端の平滑化とその後の再連結は、4つの塩基の損失につながります。 、単一のコロニーを摘み、それらのプラスミドDNA、41を単離し、制限消化および配列決定によってさらに分析し、 大腸菌 XL1 Blueにステップ変換によってこれらの塩基の損失を確認してください。 シングルクロスオーバーの結合は、 ストレプトミセスに構築します 熱ショック変換40によって大腸菌 ET12567 pUZ8002 42（カナマイシンR）に欠失を有するpokPI遺伝子 （pKC1132_ pokPIデル）を含む自殺ベクターを転送します。 100 mLのLB培地中で細胞をインキュベート（カナマイシンを50μgmLの-1、アプラマイシンを50μgmLの-1 </sup>）、37℃で一晩。遠心分離により細胞を回収し（3,000×gで、10分間、4℃）し、50 mLのLB培地に再懸濁することにより細胞を2回洗浄します。最後に、2×500μLのLB培地中で細胞を再懸濁。 ミックス500μL 大腸菌 pUZ8002 pKC1132_ pokPIデル500μL ストレプトミセスdiastatochromogenes文化を持つ（あるいは胞子を使用します）。 （1.5％、水道水1 L寒天、大豆粉20グラム、D-マンニトール20グラム、のMgCl 2 10mMの）MSプレート上で混合物を広げます。 28℃で20時間プレートをインキュベートします。 アプラマイシン（1.25 mg）を水1mLに溶解ホスホマイシン（5 mg）を持つ各プレートをオーバーレイし、それらを乾燥させてください。接合完了体が表示されるまで28℃で数日間培養します。 シングルクロスオーバー突然変異体をチェック 20mLのTSB培地（50ミリグラムmLのアプラマイシン-1）で、単一の接合完了体を接種し、3日間、180 rpmで28℃でそれらをインキュベートします。ゲノムDNA 43を単離し、PCRによりpokPI遺伝子の中断を確認してください。 100 mLのHA媒体で検証遺伝子中断およびストレプト野生型株を持つ単一のクローンを植菌し、28℃、180rpmで6日間のためにそれらをインキュベートします。 （セクション1.3を参照）粗抽出物を抽出します。 HPLC-MS分析によって、化合物の生成を確認してください（1.4節を参照）。 HPLCクロマトグラムにおける対応するピークと化合物の質量は、任意の複数の検出可能であってはならない（ 図6を参照）。 図6：S.のHPLC分析は、不活化pokPIジーンとdiastatochromogenes。 S.の粗抽出物のHPLCクロマトグラム（λ= 430 nm）を中断pokPI -Gen（下記）とWT（上）と変異株をdiastatochromogenes。変異株はもうpolyketomycin生成されません。この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。