Encyclopedia of Experiments: Cancer Research
Se requiere una suscripción a JoVE para ver este contenido. Inicie sesión o comience su prueba gratuita.
Transcript
Please note that all translations are automatically generated.
För att börja, ta en lämplig koncentration av smält agarose i ett koniskt rör och tillsätt en önskad mängd varmt odlingsmedium till det. Vänd försiktigt för att blanda innehållet. Tillsätt denna blandning i varje brunn på en sexbrunnsplatta och låt den stelna. Det här är det nedre lagret. Därefter behandla cancerceller med intresseföreningen och tillsätt den nödvändiga koncentrationen av agaros.
Häll nu denna blandning som innehåller önskat antal celler per milliliter i varje brunn. Det här är ett cellinnehållande lager. När mediet stelnat, inkubera plattan vid 37 grader Celsius i en vecka. Förbered ett matarskikt genom att blanda agarosa till mediet och komplettera denna blandning med intresseföreningen. Tillsätt försiktigt detta matarskikt i varje brunn, låt det stelna och inkubera plattan vid 37 grader Celsius.
Upprepa denna utfodringsprocedur varje vecka för att fylla på cellerna med mediet tills kolonierna bildas. Om föreningen av intresse är en hämmare av tumorigenicity, det kommer att undertrycka celltillväxt som resulterar i få kolonier i brunnarna. I följande protokoll kommer vi att utföra en mjuk agarkolonibildningsanalys för att studera effekten av PADI-hämmare på tumörogeniteten hos bröstcancerceller.
Börja denna procedur genom att förbereda 3% 2-hydroxyetylagaros. Tillsätt 0,9 gram 2-hydroxietylagarosa följt av 30 milliliter destillerat vatten i en ren, torr glasflaska på 100 milliliter. Mikrovåg blandningen i 15 sekunder och snurra försiktigt. Upprepa detta steg tills agarospulvret helt löses upp. Sedan autoklavera lösningen som innehåller flaska i 15 minuter.
Låt agaroslösningen svalna till rumstemperatur innan den används vidare. Förvärm flera fem milliliter och 10 milliliter pipetter i en 37 grader Celsius inkubator för att förhindra att agaros stelna i pipetten vid hantering. Lossa delvis flasklocket och mikrovågsugnen den förgjorda 3% 2-hydroxyetylagaroslösningen i 15 sekunder. Snurra sedan försiktigt lösningen och mikrovågsugnen i ytterligare 15 sekunder.
Var försiktig när du virvlar agarosalösningen eftersom lösningen stiger upp när den utsätts för luft och kan spilla över. Om det finns kvarvarande fast gel i flaskan, mikrovågsugn i några sekunder till. Håll flaskan som innehåller agaroslösningen i ett 45 grader Celsius vattenbad under nästa steg för att förhindra att agaroslösningen stelnar för tidigt.
Överför sedan 12 milliliter uppvärmda medier med hjälp av de förvärmda pipetterna till ett sterilt koniskt rör på 50 milliliter. Tillsätt omedelbart tre milliliter av 3% agaroslösning och vänd försiktigt det koniska röret för att blanda agarosen med mediet. Tillsätt sedan försiktigt två milliliter av denna blandning i varje brunn på en sexbrunns odlingsplatta utan att bilda några luftbubblor. Inkubera odlingsplattan med sex brunnar horisontellt på en plan yta vid fyra grader Celsius i en timme så att blandningen kan stelna.
När blandningen stelnat, placera plattan i en 37 grader Celsius inkubator i 30 minuter. Det nedre lagret är nu klart att användas.
En svår aspekt av detta förfarande är att se till att alla celler fördelas lika och att den smälta agarosgelen inte stelnar före tillsats till varje brunn, för att säkerställa att cellerna blandas i mediet innan du tillsätter den flytande agarosgelen. Dessutom är pipetterna förvärmda i förväg för att undvika att lösningarna stelnar under hanteringen.
För att förbereda cellen som innehåller lager, prova först MCF10DCIS-celler och späd dem till en cellkoncentration på 40 000 celler per milliliter. Ta sedan åtta milliliter media med förvärmda pipetter och överför till ett sterilt koniskt rör på 50 milliliter. Tillsätt omedelbart två milliliter 3% agarose till det koniska röret och vänd försiktigt för att blanda agarosen med mediet. Undvik att bilda några bubblor.
Ta sedan två milliliter av cellerna och behandla dem med två mikromolar BB-klor-amidin i DMSO, eller DMSO ensam som kontroll. Efter behandling, blanda cellerna med en 0,6% agarose i en en till en utspädning för att göra en slutlig koncentration av en mikromolar BB-klor-amidin. Ta sedan en milliliter av cellagarosblandningen och tillsätt försiktigt på bottenskiktet på den sexbrunniga odlingsplattan.
Placera odlingsplattan med sex brunnar horisontellt på en plan yta på fyra grader Celsius i minst 15 minuter så att det övre lagret kan stelna. När blandningen stelnat, placera plattan i en 37 grader Celsius inkubator i en vecka innan du lägger till matningsskiktet. Börja mata skiktpreparatet genom att mikrovåga den förgjorda 3% 2-hydroxyetylagarosalösningen som tidigare och balansera agaroslösningsflaskan i ett 45 grader Celsius vattenbad.
Blanda en milliliter 3% agaroslösning med nio milliliter varmt medium i ett koniskt rör på 50 milliliter och vänd försiktigt för att blanda agarosen med mediet. Undvik att bilda luftbubblor. Efter behandling av blandningen med BB-klor-amidin, tillsätt försiktigt en milliliter av blandningen i varje brunn på den sexbrunniga odlingsplattan som innehåller botten och mjuka lager. Placera sedan odlingsplattan med sex brunnar horisontellt på en plan yta vid fyra grader Celsius i minst 15 minuter för att låta blandningen stelna.
När matarskiktet stelnat, placera plattan i en 37 grader Celsius inkubator. Upprepa denna utfodringsprocedur varje vecka genom att överlagra en milliliter 0,3% agarose medium behandlingslösning på det befintliga matarskiktet för att fylla på cellerna med nya medier tills kolonibildning observeras.
