Encyclopedia of Experiments: Cancer Research
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시작하려면, 원문 튜브에 용융 아가로즈의 적절한 농도를 가지고 그것에 따뜻한 배양 매체의 원하는 양을 추가합니다. 내용내용을 혼합하려면 부드럽게 반전합니다. 이 혼합물을 6웰 플레이트의 각 웰에 넣고 고화시키도록 합니다. 맨 아래 레이어입니다. 다음으로, 관심의 화합물로 암세포를 치료하고 아가로즈의 필요한 농도를 추가한다.
지금, 각 우물에 밀리리터 당 세포의 원하는 수를 포함하는이 혼합물을 부어. 이것은 셀 함유 층입니다. 매체가 고성되면 일주일 동안 섭씨 37도에서 플레이트를 배양합니다. 아가로즈를 배지에 혼합하여 피더 층을 준비하고 관심 있는 화합물로 이 혼합물을 보완한다. 이 피더 층을 각 우물에 부드럽게 넣고 고화시키고 37°C에서 플레이트를 배양할 수 있습니다.
이 먹이 절차를 매주 반복하여 식민지가 형성될 때까지 배지로 세포를 보충하십시오. 관심의 화합물이 종양 유발성의 억제제인 경우, 우물에서 몇 가지 식민지의 결과로 세포 성장을 억제합니다. 다음 프로토콜에서, 우리는 유방암 세포의 종양유발성에 PADI 억제제의 효력을 연구하기 위하여 연약한 한천 식민지 형성 분석기를 능력을 발휘할 것입니다.
3% 2-하이드록세틸 아가로즈를 준비하여 이 절차를 시작합니다. 깨끗하고 건조한 100 밀리리터 유리 병에 넣고 0.9 그램의 2-하이드록산술 아가로즈를 넣고 30 밀리리터의 증류수를 넣습니다. 혼합물을 15초 동안 전자레인지에 넣고 부드럽게 소용돌이시다. 아가로즈 파우더가 완전히 녹을 때까지 이 단계를 반복하십시오. 다음으로 병을 포함하는 용액을 15분 동안 자동 복제합니다.
아가로즈 용액을 추가 사용 전에 실온으로 식히도록 허용하십시오. 처리 시 아가로즈가 파이펫에 고화되는 것을 방지하기 위해 섭씨 37도의 인큐베이터에서 5밀리리터와 10밀리리터 파이펫을 미리 데우기 위해 미리 데워집니다. 병 뚜껑을 부분적으로 풀고 15초 동안 미리 만들어진 3% 2-하이드록시틸 아가로즈 용액을 전자레인지에 담급니다. 그런 다음 용액을 부드럽게 소용돌이고 전자 레인지를 15 초 간 더 돌리십시오.
공기에 노출되면 용액이 상승하고 유출 될 수 있기 때문에 아가로즈 용액을 소용돌이 시주의하십시오. 병에 잔류 솔리드 젤이 있으면 몇 초 더 전자 레인지에 전자 레인지. 아가로즈 용액이 함유된 병을 다음 단계 동안 45도의 수조에 보관하여 아가로즈 용액이 조기에 고화되는 것을 방지합니다.
다음으로, 미리 데운 파이펫을 사용하여 12밀리리터의 온난한 미디어를 멸균 50 밀리리터 원내 튜브로 옮킨다. 즉시 3% 아가로즈 용액의 3밀리리터를 추가하고 원추형 튜브를 부드럽게 반전하여 아가로즈를 미디어와 혼합합니다. 그런 다음 기포를 형성하지 않고 6웰 배양 플레이트의 각 웰에 이 혼합물의 2 밀리리터를 부드럽게 넣습니다. 혼합물이 고화될 수 있도록 섭씨 4도에서 평평한 표면에 수평으로 6웰 배양판을 배양합니다.
혼합물이 고화되면 플레이트를 섭씨 37도 인큐베이터에 30분 동안 넣습니다. 이제 하단 레이어를 사용할 준비가 되었습니다.
이 절차의 어려운 측면은 모든 세포가 동등하게 분포되고 용융 된 아가로즈 젤이 각 우물에 첨가하기 전에 응고하지 않도록하여 세포가 액체 아가로즈 젤을 첨가하기 전에 미디어에 혼합되도록하는 것입니다. 또한 파이펫은 처리 하는 동안 응고에서 솔루션을 피하기 위해 미리 따뜻하게.
층을 포함하는 세포를 준비하기 위하여는, 먼저 MCF10DCIS 세포를 시도하고 밀리리터 당 40,000 세포의 세포 농도로 희석합니다. 그런 다음 미리 데운 파이펫을 사용하여 8 밀리리터의 미디어를 가져 와서 멸균 50 밀리리터 원컬 튜브로 옮김하십시오. 즉시 원추형 튜브에 3 %의 아가로즈 2 밀리리터를 추가하고 부드럽게 반전하여 아가로즈를 미디어와 혼합합니다. 거품을 형성하지 마십시오.
다음으로, 세포의 2밀리리터를 가지고 DMSO에서 2개의 마이크로몰라 BB-클로르-아미딘또는 DMSO단독으로 대조군으로 취급한다. 치료 후, 세포를 0.6% 아가로즈와 1 대 1 희석으로 혼합하여 1 개의 마이크로 몰라 BB-클로르 아미딘의 최종 농도를 만듭니다. 그런 다음 세포 아가로즈 혼합물의 1 밀리리터를 복용하고 6웰 배양 판의 바닥 층에 부드럽게 추가합니다.
6웰 배양판을 평평한 표면에 4°C이상 수평으로 놓고 상단 층이 굳어지도록 합니다. 혼합물이 고화된 후, 공급 층을 추가하기 전에 1 주일 동안 37섭씨 인큐베이터에 접시를 놓습니다. 사전 제작된 3% 2-하이드록시틸 아가로즈 용액을 마이크로웨이브하고, 아가로즈 용액병을 섭씨 45도의 수조에 계측하여 공급층 준비를 시작한다.
3밀리리터의 3밀리리터와 따뜻한 미디어 9밀리리터를 50밀리리터 원뿔 튜브에 넣고 아가로즈를 미디어와 혼합합니다. 기포를 형성하지 마십시오. BB-클로르 아미딘으로 혼합물을 치료한 후, 바닥과 부드러운 층을 포함하는 6웰 배양판의 각 웰에 혼합물 1밀리리터를 부드럽게 넣습니다. 그런 다음 6웰 배양판을 평평한 표면에 4°C이상 수평으로 놓고 혼합물이 고화되도록 적어도 15분간 배치합니다.
피더 층이 고화되면 플레이트를 섭씨 37도 인큐베이터에 넣습니다. 식민지 형성이 관찰될 때까지 세포를 새로운 배지로 보충하기 위해 기존 피더 층에 0.3%의 아가로즈 중간 처리 용액을 1밀리리터를 오버레이하여 매주 이 먹이 주기 절차를 반복한다.
