Soft Agar Colony Formation Assay: Eine Methode, um Auswirkungen neuartiger Verbindungen auf die Proliferation von Krebszellen zu testen

Nehmen Sie zunächst eine entsprechende Konzentration von geschmolzener Agarose in einem konischen Rohr und fügen Sie eine gewünschte Menge warmes Kulturmedium dazu. Sanft invertieren, um den Inhalt zu mischen. Fügen Sie diese Mischung in jeden Brunnen einer Sechs-Brunnen-Platte, und lassen Sie es zu erstarren. Dies ist die untere Ebene. Als nächstes behandeln Sie Krebszellen mit der Verbindung von Interesse und fügen Sie die erforderliche Konzentration von Agarose hinzu.

Gießen Sie nun diese Mischung, die die gewünschte Anzahl von Zellen pro Milliliter enthält, in jeden Brunnen. Dies ist eine zellhaltige Schicht. Sobald das Medium erstarrt, bebrüten die Platte bei 37 Grad Celsius für eine Woche. Bereiten Sie eine Feederschicht durch Mischen von Agarose auf das Medium und ergänzen Sie diese Mischung mit der Verbindung von Interesse. Fügen Sie diese Feederschicht vorsichtig in jeden Brunnen ein, lassen Sie sie erstarren und bebrüten die Platte bei 37 Grad Celsius.

Wiederholen Sie diesen Fütterungsvorgang wöchentlich, um die Zellen mit dem Medium aufzufüllen, bis sich Kolonien bilden. Wenn die Verbindung von Interesse ist ein Inhibitor der Tumorigenität, Es wird Zellenwachstum unterdrücken, was zu wenigen Kolonien in den Brunnen. Im folgenden Protokoll führen wir einen Test zur Bildung von Weichagarkolonien durch, um die Wirkung von PADI-Hemmern auf die Tumorigenität von Brustkrebszellen zu untersuchen.

Beginnen Sie dieses Verfahren, indem Sie 3% 2-Hydroxyethyl-Agarose zubereiten. In eine saubere, trockene 100-Milliliter-Glasflasche 0,9 Gramm 2-Hydroxyethyl-Agarose, gefolgt von 30 Milliliter destilliertem Wasser. Mikrowelle die Mischung für 15 Sekunden und sanft wirbeln. Wiederholen Sie diesen Schritt, bis sich das Agarosepulver vollständig auflöst. Als nächstes autoklavieren Sie die Lösung mit Flasche für 15 Minuten.

Lassen Sie die Agarose-Lösung vor dem weiteren Gebrauch auf Raumtemperatur abkühlen. Vorwärmte mehrere Fünf-Milliliter- und 10-Milliliter-Pipetten in einem 37 Grad Celsius Inkubator, um zu verhindern, dass sich die Agarose bei der Handhabung in der Pipette erstarrt. Lösen Sie den Flaschendeckel und die Mikrowelle 15 Sekunden lang die vorgefertigte 3% 2-Hydroxyethyl-Agarose-Lösung teilweise. Dann wirbeln Sie die Lösung und Die Mikrowelle für weitere 15 Sekunden vorsichtig.

Seien Sie vorsichtig, wenn Sie die Agarose-Lösung wirbeln, da die Lösung aufsteigt, wenn sie Luft ausgesetzt ist und überschwappen kann. Wenn es Rest-Festgel in der Flasche, Mikrowelle für ein paar weitere Sekunden. Bewahren Sie die Flasche mit der Agaroselösung in einem 45 Grad Celsius Wasserbad während der nächsten Schritte auf, um eine vorzeitige Erstarrung der Agaroselösung zu verhindern.

Als nächstes übertragen Sie 12 Milliliter erwärmte Medien mit den vorgewärmten Pipetten in ein steriles 50 Milliliter konisches Rohr. Fügen Sie sofort drei Milliliter der 3% Agarose-Lösung hinzu und invertieren Sie das konische Rohr vorsichtig, um die Agarose mit den Medien zu mischen. Dann fügen Sie vorsichtig zwei Milliliter dieser Mischung in jeden Brunnen einer Sechs-Brunnen-Kulturplatte, ohne luftblasen zu bilden. Die Sechs-Brunnen-Kulturplatte horizontal auf einer ebenen Oberfläche bei vier Grad Celsius für eine Stunde inkubieren, damit sich die Mischung erstarren kann.

Nachdem sich die Mischung erstarrt, legen Sie die Platte 30 Minuten lang in einen 37 Grad Celsius Inkubator. Die untere Ebene ist nun einsatzbereit.

Ein schwieriger Aspekt dieses Verfahrens ist es, sicherzustellen, dass alle Zellen gleichmäßig verteilt sind und dass das geschmolzene Agarose-Gel nicht vor Zugabe zu jedem Brunnen erstarrt, um sicherzustellen, dass die Zellen in den Medien gemischt werden, bevor das flüssige Agarose-Gel hinzugefügt wird. Zusätzlich werden die Pipetten vorab vorgewärmt, um zu vermeiden, dass sich die Lösungen beim Handling erstarren.

Um die zellhaltige Schicht vorzubereiten, versuchen Sie zunächst MCF10DCIS-Zellen zu trypsinisieren und verdünnen sie auf eine Zellkonzentration von 40.000 Zellen pro Milliliter. Nehmen Sie dann acht Milliliter Medien mit vorgewärmten Pipetten und übertragen Sie in ein steriles 50 Milliliter konisches Rohr. Fügen Sie sofort zwei Milliliter 3% Agarose in das konische Rohr und sanft invertieren, um die Agarose mit den Medien zu mischen. Vermeiden Sie es, Blasen zu bilden.

Als nächstes nehmen Sie zwei Milliliter der Zellen und behandeln Sie sie mit zwei mikromollaren BB-Chlor-Amidin in DMSO, oder DMSO allein als Kontrolle. Mischen Sie die Zellen nach der Behandlung mit einer Agarose von 0,6% in einer Verdünnung von eins zu eins, um eine endende Konzentration von einem mikromollaren BB-Chlor-Amidin herzustellen. Dann einen Milliliter der Zell-Agarose-Mischung nehmen und vorsichtig auf die untere Schicht der Sechs-Brunnen-Kulturplatte geben.

Legen Sie die Sechs-Brunnen-Kulturplatte horizontal auf einer ebenen Oberfläche bei vier Grad Celsius für mindestens 15 Minuten, damit sich die obere Schicht festigen kann. Nachdem sich die Mischung verfestigt hat, legen Sie die Platte eine Woche lang in einen 37 Grad Celsius Inkubator, bevor Sie die Zuführschicht hinzufügen. Beginnen Sie mit der Fütterungsschichtvorbereitung, indem Sie die vorgefertigte 3% 2-Hydroxyethyl-Agarose-Lösung wie bisher mikrowadieben und die Agarose-Lösungsflasche in einem 45 Grad Celsius Wasserbad ausbalancieren.

Mischen Sie einen Milliliter 3% Agarose-Lösung mit neun Milliliter warme Medien in eine 50 Milliliter konische Röhre, und sanft invertieren, um die Agarose mit den Medien zu mischen. Vermeiden Sie die Bildung von Luftblasen. Nach der Behandlung der Mischung mit BB-Chlor-Amidin, sanft einen Milliliter der Mischung in jeden Brunnen der Sechs-Well-Kulturplatte mit dem Boden und weichen Schichten. Dann legen Sie die Sechs-Brunnen-Kulturplatte horizontal auf einer ebenen Oberfläche bei vier Grad Celsius für mindestens 15 Minuten, damit die Mischung verfestigt werden kann.

Nachdem sich die Zufessschicht verfestigt hat, legen Sie die Platte in einen 37 Grad Celsius Brutkasten. Wiederholen Sie diesen Fütterungsvorgang wöchentlich, indem Sie einen Milliliter 0,3% Agarose-Medium-Behandlungslösung auf die vorhandene Feederschicht überlagern, um die Zellen mit neuen Medien aufzufüllen, bis die Koloniebildung beobachtet wird.