Encyclopedia of Experiments: Cancer Research
Se requiere una suscripción a JoVE para ver este contenido. Inicie sesión o comience su prueba gratuita.
Transcript
Please note that all translations are automatically generated.
للبدء، واتخاذ تركيز مناسب من الآغاروز المنصهر في أنبوب مخروطي وإضافة كمية المطلوب من الثقافة الدافئة المتوسطة لذلك. عكس بلطف لخلط المحتويات. إضافة هذا الخليط في كل بئر من لوحة من ستة آبار، والسماح لها لترسيخ. هذه هي الطبقة السفلى. بعد ذلك، علاج الخلايا السرطانية مع مجمع الفائدة وإضافة التركيز المطلوب من الآغاروز.
الآن، صب هذا الخليط الذي يحتوي على العدد المطلوب من الخلايا لكل ملليلتر في كل بئر. هذه طبقة تحتوي على خلايا. بمجرد أن يتماسك الوسط ، احتضن اللوحة عند 37 درجة مئوية لمدة أسبوع. إعداد طبقة التغذية عن طريق خلط الآغاروز إلى المتوسط وتكملة هذا الخليط مع مجمع الفائدة. أضف هذه الطبقة المغذية برفق إلى كل بئر، واسمح لها بترسيخ اللوحة واحتضانها عند 37 درجة مئوية.
كرر إجراء التغذية هذا أسبوعيا لتجديد الخلايا بالوسط حتى تتشكل المستعمرات. إذا كان مركب الفائدة هو مثبط للورم ، فإنه سيقمع نمو الخلايا مما يؤدي إلى عدد قليل من المستعمرات في الآبار. في البروتوكول التالي، سوف نقوم بإجراء فحص تشكيل مستعمرة أجار لينة لدراسة تأثير مثبطات PADI على الورم من خلايا سرطان الثدي.
بدء هذا الإجراء عن طريق إعداد 3٪ 2 هيدروكسي إيثيل أغاروز. في زجاجة نظيفة وجافة 100 ملليلتر، إضافة 0.9 غرام من 2-هيدروكسي إيثيل أجاروز تليها 30 ملليلتر من الماء المقطر. الميكروويف الخليط لمدة 15 ثانية ودوامة بلطف. كرر هذه الخطوة حتى يذوب مسحوق الآغاروز بالكامل. بعد ذلك ، قم بتعقيم المحلول الذي يحتوي على زجاجة لمدة 15 دقيقة.
السماح للحل agarose لتهدئة لدرجة حرارة الغرفة قبل مزيد من الاستخدام. قبل الحارة عدة خمسة ملليلتر و 10 ملليلتر ماصة في حاضنة 37 درجة مئوية لمنع agarose من ترسيخ في ماصة عند التعامل معها. تخفيف جزئيا غطاء زجاجة والميكروويف الجاهزة 3٪ 2 هيدروكسي إيثيل agarose الحل لمدة 15 ثانية. ثم دوامة بلطف الحل والميكروويف لمدة 15 ثانية أخرى.
كن حذرا عند تدوير حل agarose لأن الحل يرتفع عندما يتعرض للهواء ويمكن أن يمتد. إذا كان هناك هلام الصلبة المتبقية في زجاجة، الميكروويف لبضع ثوان أخرى. الحفاظ على زجاجة تحتوي على محلول agarose في حمام مائي 45 درجة مئوية خلال الخطوات التالية لمنع محلول الآغاروز من ترسيخ قبل الأوان.
بعد ذلك، نقل 12 ملليلتر من وسائل الإعلام الدافئة باستخدام ماصة ساخنة مسبقا إلى أنبوب مخروطي معقم 50 ملليلتر. أضف على الفور ثلاثة ملليلترات من محلول الآغاروز بنسبة 3٪ وعكس الأنبوب المخروطي برفق لخلط الآغاروز مع الوسائط. ثم أضف بلطف اثنين من ملليلتر من هذا الخليط في كل بئر من لوحة ثقافة ستة آبار دون تشكيل أي فقاعات الهواء. احتضان لوحة ثقافة ستة آبار أفقيا على سطح مستو في أربع درجات مئوية لمدة ساعة واحدة للسماح للخليط لترسيخ.
بعد أن يتماسك الخليط، ضع الطبق في حاضنة 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. الطبقة السفلية جاهزة الآن للاستخدام.
الجانب الصعب من هذا الإجراء هو التأكد من أن جميع الخلايا يتم توزيعها بالتساوي وأن هلام الآغاروز الذائب لا يتوطد قبل إضافة كل بئر ، لضمان خلط الخلايا في الوسائط قبل إضافة جل الآغاروز السائل. بالإضافة إلى ذلك يتم تسخين ماصة مسبقا مسبقا لتجنب الحلول من ترسيخ أثناء التعامل معها.
لإعداد الخلية التي تحتوي على طبقة، جرب أولا خلايا MCF10DCIS وتمييعها إلى تركيز خلية من 40،000 خلية لكل ملليلتر. ثم تأخذ ثمانية ملليلتر من وسائل الإعلام باستخدام ماصة ساخنة مسبقا، ونقلها إلى أنبوب مخروطي 50 ملليلتر معقمة. إضافة على الفور اثنين من ملليلتر من 3٪ agarose إلى أنبوب مخروطي، وعكس بلطف لخلط agarose مع وسائل الإعلام. تجنب تشكيل أي فقاعات.
بعد ذلك ، خذ ملليلترين من الخلايا وعالجها باثنين من الكائنات الدقيقة BB-chlor-amidine في DMSO ، أو DMSO وحدها كعنصر تحكم. بعد العلاج، اخلطي الخلايا مع agarose 0.6٪ في تخفيف واحد إلى واحد لجعل التركيز النهائي من واحد ميكرومولار BB-chlor-أميدين. ثم تأخذ ملليلتر واحد من خليط الخلية-agarose وإضافة بلطف على الطبقة السفلية من لوحة ثقافة ستة آبار.
ضع لوحة الثقافة ذات الست آبار أفقيا على سطح مستو عند أربع درجات مئوية لمدة 15 دقيقة على الأقل للسماح للطبقة العليا بترسيخها. بعد صلابة الخليط، ضع الطبق في حاضنة 37 درجة مئوية لمدة أسبوع قبل إضافة طبقة التغذية. البدء في إعداد طبقة التغذية عن طريق microwaving مسبقة الصنع 3٪ 2 هيدروكسي إيثيل agarose الحل كما كان من قبل، وتوازن زجاجة حل agarose في حمام مائي 45 درجة مئوية.
مزيج ملليلتر واحد من محلول agarose 3٪ مع تسعة ملليلتر من وسائل الإعلام الدافئة في أنبوب مخروطي 50 ملليلتر، وعكس بلطف لخلط agarose مع وسائل الإعلام. تجنب تشكيل فقاعات الهواء. بعد معالجة الخليط مع BB-chlor-amidine، أضف بلطف ملليلتر واحد من الخليط إلى كل بئر من لوحة الثقافة ذات الست آبار التي تحتوي على الطبقات السفلية والناعمة. ثم ضع لوحة الثقافة سداسية الآبار أفقيا على سطح مستو في أربع درجات مئوية لمدة 15 دقيقة على الأقل للسماح للخليط لترسيخ.
بعد أن تتماسك الطبقة المغذية، ضع اللوحة في حاضنة 37 درجة مئوية. كرر هذا الإجراء التغذية أسبوعيا عن طريق تراكب ملليلتر واحد من 0.3٪ agarose حل العلاج المتوسط على طبقة التغذية الموجودة لتجديد الخلايا مع وسائل الإعلام الجديدة حتى يتم ملاحظة تشكيل مستعمرة.
