Encyclopedia of Experiments: Cancer Research
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शुरू करने के लिए, एक शंकु नली में पिघला हुआ agarose की एक उपयुक्त एकाग्रता ले और यह करने के लिए गर्म संस्कृति माध्यम की एक वांछित राशि जोड़ें । सामग्री को मिलाने के लिए धीरे-धीरे उलटा करें। इस मिश्रण को छह-अच्छी प्लेट के प्रत्येक कुएं में जोड़ें, और इसे जमने दें। यह निचली परत है। इसके बाद, ब्याज के यौगिक के साथ कैंसर की कोशिकाओं का इलाज करें और एगरे की आवश्यक एकाग्रता जोड़ें।
अब, प्रत्येक कुएं में प्रति मिलीलीटर कोशिकाओं की वांछित संख्या वाले इस मिश्रण को डालें। यह सेल युक्त परत है। एक बार मध्यम जम जाता है, एक सप्ताह के लिए ३७ डिग्री सेल्सियस पर थाली इनक्यूबेट । एक फीडर परत को माध्यम में मिलाकर तैयार करें और इस मिश्रण को ब्याज के यौगिक के साथ पूरक करें। धीरे-धीरे प्रत्येक कुएं में इस फीडर परत को जोड़ें, इसे जमना, और प्लेट को 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करने की अनुमति दें।
इस भोजन प्रक्रिया को साप्ताहिक दोहराएं ताकि कोशिकाओं को माध्यम से भरपाई न की जा सके जब तक कि उपनिवेश नहीं बन जाते। यदि ब्याज का यौगिक ट्यूमरजन्यता का अवरोधक है, तो यह कोशिकाओं के विकास को दबा देगा जिसके परिणामस्वरूप कुओं में कुछ उपनिवेश हैं। निम्नलिखित प्रोटोकॉल में, हम स्तन कैंसर कोशिकाओं की ट्यूमरीजेनिकिटी पर पैडी अवरोधकों के प्रभाव का अध्ययन करने के लिए एक नरम आगर कॉलोनी गठन परख करेंगे।
3% 2-हाइड्रोक्सीथिल एगर उठी तैयार करके इस प्रक्रिया को शुरू करें। एक साफ, सूखी 100 मिलीलीटर कांच की बोतल में, 0.9 ग्राम 2-हाइड्रोक्सीथिल एगर उठी और उसके बाद 30 मिलीलीटर आसुत पानी जोड़ें। 15 सेकंड के लिए मिश्रण माइक्रोवेव और धीरे से भंवर । इस कदम को तब तक दोहराएं जब तक कि एगर उठे पाउडर पूरी तरह से घुल न जाए। इसके बाद, 15 मिनट के लिए बोतल युक्त समाधान को ऑटोक्लेव करें।
आगे के उपयोग से पहले कमरे के तापमान को ठंडा करने के लिए एगर उठे समाधान की अनुमति दें। पूर्व गर्म कई पांच मिलीलीटर और 10 मिलीलीटर पिपेट एक ३७ डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में agarose को रोकने के लिए जब से निपटने के पिपेट में जमना से । आंशिक रूप से बोतल के ढक्कन को ढीला करें और माइक्रोवेव पूर्व निर्मित 3% 2-हाइड्रोक्सीथिल एगर उठे समाधान को 15 सेकंड के लिए करें। फिर धीरे-धीरे समाधान और माइक्रोवेव को 15 सेकंड के लिए घूमता है।
एगर उठे समाधान को घूमता समय सावधान रहें क्योंकि हवा के संपर्क में आने पर समाधान बढ़ जाता है और फैल सकता है। यदि बोतल में अवशिष्ट ठोस जेल है, तो कुछ और सेकंड के लिए माइक्रोवेव। अगले चरणों के दौरान अगले चरणों के दौरान एगर उठे समाधान को समय से पहले जमना से रोकने के लिए अगले चरणों में एगर उठे समाधान से युक्त बोतल रखें।
इसके बाद, एक बाँझ 50 मिलीलीटर शंकुवाक में पूर्व-गर्म पिपेट का उपयोग करके गर्म मीडिया के 12 मिलीलीटर स्थानांतरित करें। तुरंत 3% एगर उठे समाधान के तीन मिलीलीटर जोड़ें और धीरे-धीरे मीडिया के साथ एगर उठी मिश्रण करने के लिए शंकु ट्यूब को उलट दें। फिर धीरे-धीरे किसी भी हवा बुलबुले बनाने के बिना एक छह अच्छी तरह से संस्कृति प्लेट के प्रत्येक कुएं में इस मिश्रण के दो मिलीलीटर जोड़ें। छह अच्छी तरह से संस्कृति प्लेट क्षैतिज एक घंटे के लिए चार डिग्री सेल्सियस पर एक सपाट सतह पर इनक्यूबेट मिश्रण जमना करने के लिए अनुमति देते हैं ।
मिश्रण जम जाने के बाद, प्लेट को 30 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में रखें। नीचे की परत अब उपयोग के लिए तैयार है।
इस प्रक्रिया का एक कठिन पहलू यह सुनिश्चित करना है कि सभी कोशिकाओं को समान रूप से वितरित किया जाए और पिघले हुए एगरेजर जेल प्रत्येक कुएं के अलावा से पहले जमना न करें, यह सुनिश्चित करने के लिए कि तरल एगर उठे जेल को जोड़ने से पहले कोशिकाओं को मीडिया में मिलाया जाए। इसके अतिरिक्त, पिपेट को हैंडलिंग करते समय जमना से समाधानों से बचने के लिए पहले से गर्म किया जाता है।
परत युक्त कोशिका को तैयार करने के लिए, सबसे पहले MCF10DCIS कोशिकाओं को ट्राइपसिनाइज करें और उन्हें 40,000 कोशिकाओं प्रति मिलीलीटर की कोशिका एकाग्रता में पतला करें। फिर पूर्व-गर्म पिपेट का उपयोग करके मीडिया के आठ मिलीलीटर लें, और एक बाँझ 50 मिलीलीटर शंकु नली में स्थानांतरित करें। तुरंत शंकु नली में 3% एगर उठे के दो मिलीलीटर जोड़ें, और धीरे-धीरे मीडिया के साथ एग्राम को मिलाने के लिए उलटा करें। किसी भी बुलबुले बनाने से बचें।
इसके बाद, कोशिकाओं के दो मिलीलीटर लें और उन्हें DMSO में दो माइक्रोमोलर बीबी-क्लोर-एमिसिन के साथ इलाज करें, या नियंत्रण के रूप में अकेले डीएमएसओ। उपचार के बाद, कोशिकाओं को एक माइक्रोमोलर बीबी-क्लोर-एमीसिन की अंतिम एकाग्रता बनाने के लिए एक से एक कमजोर पड़ने में 0.6% एग्राम के साथ मिलाएं। फिर सेल-एगर उठे मिश्रण का एक मिलीलीटर लें और धीरे-धीरे छह-अच्छी संस्कृति प्लेट की निचली परत पर जोड़ें।
शीर्ष परत को जमना करने की अनुमति देने के लिए कम से कम 15 मिनट के लिए चार डिग्री सेल्सियस पर एक सपाट सतह पर क्षैतिज रूप से छह अच्छी तरह से संस्कृति प्लेट रखें। मिश्रण जम जाने के बाद, प्लेट को फीडिंग लेयर जोड़ने से पहले एक सप्ताह के लिए 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में रखें। पहले की तरह पूर्व निर्मित 3% 2-हाइड्रोक्सीथिल एगर उठे समाधान को माइक्रोवेव करके परत तैयार करना शुरू करें, और 45 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में एग्राडेड समाधान बोतल को बराबर करें।
3% एगरजिंग समाधान का एक मिलीलीटर 50 मिलीलीटर शंकु नली में गर्म मीडिया के नौ मिलीलीटर के साथ मिलाएं, और धीरे-धीरे मीडिया के साथ एग्लेड को मिलाने के लिए उलटा करें। हवा के बुलबुले बनाने से बचें। बीबी-क्लोर-अमीसिन के साथ मिश्रण का इलाज करने के बाद, धीरे-धीरे मिश्रण का एक मिलीलीटर छह-अच्छी संस्कृति प्लेट के प्रत्येक कुएं में जोड़ें जिसमें नीचे और नरम परतें होती हैं। फिर छह अच्छी तरह से संस्कृति प्लेट को कम से कम 15 मिनट के लिए चार डिग्री सेल्सियस पर एक सपाट सतह पर क्षैतिज रूप से रखें ताकि मिश्रण को जमना जा सके।
फीडर परत जम जाने के बाद, प्लेट को 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में रखें। कॉलोनी गठन होने तक नए मीडिया के साथ कोशिकाओं की भरपाई करने के लिए मौजूदा फीडर परत पर 0.3% एगर उठे मध्यम उपचार समाधान के एक मिलीलीटर को ओवरले करके इस फीडिंग प्रक्रिया को साप्ताहिक दोहराएं।
