Soft Agar Colony Formation Assay: een methode om effecten van nieuwe verbindingen op de proliferatie van kankercellen te testen

Om te beginnen, neem een geschikte concentratie gesmolten agarose in een conische buis en voeg er een gewenste hoeveelheid warm cultuurmedium aan toe. Draai voorzichtig om om de inhoud te mengen. Voeg dit mengsel toe aan elke put van een plaat met zes putten en laat het stollen. Dit is de onderste laag. Behandel vervolgens kankercellen met de verbinding van belang en voeg de vereiste concentratie agarose toe.

Giet nu dit mengsel met het gewenste aantal cellen per milliliter in elke put. Dit is een celbevattende laag. Zodra het medium stolt, incubeer je de plaat een week lang op 37 graden Celsius. Bereid een feederlaag door agarose te mengen met het medium en vul dit mengsel aan met de samenstelling van belang. Voeg voorzichtig deze feederlaag toe aan elke put, laat het stollen en incubeer de plaat op 37 graden Celsius.

Herhaal deze voedingsprocedure wekelijks om de cellen aan te vullen met het medium totdat kolonies zich vormen. Als de verbinding van belang een remmer van tumorigeniciteit is, zal het de celgroei onderdrukken, wat resulteert in weinig kolonies in de putten. In het volgende protocol zullen we een test voor de vorming van zachte agarkolonies uitvoeren om het effect van PADI-remmers op de tumorigeniciteit van borstkankercellen te bestuderen.

Begin deze procedure door 3% 2-hydroxyethylagarose voor te bereiden. Voeg in een schone, droge glazen fles van 100 milliliter 0,9 gram 2-hydroxyethylagarose toe, gevolgd door 30 milliliter gedestilleerd water. Magnetron het mengsel gedurende 15 seconden en wervel voorzichtig. Herhaal deze stap totdat het agarosepoeder volledig is opgelost. Autoclaaf vervolgens de oplossing met fles gedurende 15 minuten.

Laat de agarose-oplossing afkoelen tot kamertemperatuur voor verder gebruik. Verwarm enkele pipetten van vijf milliliter en 10 milliliter voor in een incubator van 37 graden Celsius om te voorkomen dat de agarose tijdens het hanteren stolt in de pipet. Maak het deksel van de fles gedeeltelijk los en magnetron de vooraf gemaakte 3% 2-hydroxyethyl agarose oplossing gedurende 15 seconden. Wervel vervolgens de oplossing en de magnetron nog 15 seconden.

Wees voorzichtig bij het wervelen van de agarose-oplossing, omdat de oplossing opstijgt wanneer deze wordt blootgesteld aan lucht en kan overlopen. Als er nog vaste gel in de fles zit, magnetron dan nog een paar seconden. Bewaar de fles met de agarose-oplossing in een waterbad van 45 graden Celsius tijdens de volgende stappen om te voorkomen dat de agarose-oplossing voortijdig stolt.

Breng vervolgens 12 milliliter opgewarmde media met behulp van de voorverwarmde pipetten over in een steriele conische buis van 50 milliliter. Voeg onmiddellijk drie milliliter van de 3% agarose-oplossing toe en keer de conische buis voorzichtig om om de agarose met de media te mengen. Voeg vervolgens voorzichtig twee milliliter van dit mengsel toe aan elke put van een kweekplaat met zes putten zonder luchtbellen te vormen. Incubeer de zes-put kweekplaat horizontaal op een vlak oppervlak bij vier graden Celsius gedurende een uur om het mengsel te laten stollen.

Nadat het mengsel stolt, plaatst u de plaat gedurende 30 minuten in een incubator van 37 graden Celsius. De onderste laag is nu klaar voor gebruik.

Een moeilijk aspect van deze procedure is om ervoor te zorgen dat alle cellen gelijk worden verdeeld en dat de gesmolten agarosegel niet stolt voordat deze aan elke put wordt toegevoegd, om ervoor te zorgen dat de cellen in de media worden gemengd voordat de vloeibare agarosegel wordt toegevoegd. Bovendien worden de pipetten vooraf voorverwarmd om te voorkomen dat de oplossingen stollen tijdens het hanteren.

Om de cel met laag voor te bereiden, probeert u eerst MCF10DCIS-cellen te dopen en te verdunnen tot een celconcentratie van 40.000 cellen per milliliter. Neem vervolgens acht milliliter media met voorverwarmde pipetten en breng over in een steriele conische buis van 50 milliliter. Voeg onmiddellijk twee milliliter van 3% agarose toe aan de conische buis en keer voorzichtig om om de agarose met de media te mengen. Vermijd het vormen van bubbels.

Neem vervolgens twee milliliter van de cellen en behandel ze met twee micromolaire BB-chloor-amidine in DMSO, of DMSO alleen als controle. Meng na de behandeling de cellen met een agarose van 0,6% in een één-op-één verdunning om een eindconcentratie van één micromolar BB-chloor-amidine te maken. Neem vervolgens een milliliter van het cel-agarosemengsel en voeg voorzichtig toe aan de onderste laag van de kweekplaat met zes putten.

Plaats de zes-put kweekplaat horizontaal op een vlak oppervlak op vier graden Celsius gedurende ten minste 15 minuten om de bovenste laag te laten stollen. Nadat het mengsel stolt, plaatst u de plaat een week in een incubator van 37 graden Celsius voordat u de voedingslaag toevoegt. Begin met het voeden van laagvoorbereiding door de vooraf gemaakte 3% 2-hydroxyethylagarose-oplossing zoals voorheen te microwaving en de agarose-oplossingsfles in een waterbad van 45 graden Celsius te equilibreren.

Meng een milliliter van 3% agarose-oplossing met negen milliliter warme media in een conische buis van 50 milliliter en keer voorzichtig om om de agarose met de media te mengen. Vermijd het vormen van luchtbellen. Voeg na behandeling van het mengsel met BB-chloor-amidine voorzichtig een milliliter van het mengsel toe aan elke put van de zes-put kweekplaat met de bodem en zachte lagen. Plaats vervolgens de zes-put kweekplaat horizontaal op een vlakke ondergrond op vier graden Celsius gedurende ten minste 15 minuten om het mengsel te laten stollen.

Nadat de feederlaag stolt, plaatst u de plaat in een incubator van 37 graden Celsius. Herhaal deze voedingsprocedure wekelijks door een milliliter van 0,3% agarose medium behandelingsoplossing op de bestaande feederlaag te bedekken om de cellen aan te vullen met nieuwe media totdat kolonievorming wordt waargenomen.