Encyclopedia of Experiments: Cancer Research
Se requiere una suscripción a JoVE para ver este contenido. Inicie sesión o comience su prueba gratuita.
Transcript
Please note that all translations are automatically generated.
כדי להתחיל, לקחת ריכוז מתאים של agarose מותך בצינור חרוט ולהוסיף כמות הרצויה של מדיום תרבות חמה אליו. הפוך בעדינות כדי לערבב את התוכן. מוסיפים את התערובת הזו לכל באר של צלחת שש בארות, ומאפשרים לה להתמצק. זו השכבה התחתונה. לאחר מכן, לטפל בתאים סרטניים עם תרכובת של עניין ולהוסיף את הריכוז הנדרש של agarose.
עכשיו, יוצקים את התערובת המכילה את המספר הרצוי של תאים למיליליטר לתוך כל באר. זוהי שכבה המכילה תאים. ברגע שהבינוני מתמצק, דגירה את הצלחת ב 37 מעלות צלזיוס במשך שבוע. הכן שכבת מאכיל על ידי ערבוב agarose למדיום ולהשלים תערובת זו עם תרכובת של עניין. מוסיפים בעדינות שכבת מאכיל זו לכל באר, מאפשרים לה להתמצק, ומדגרים את הצלחת ב-37 מעלות צלזיוס.
חזור על הליך האכלה זה מדי שבוע כדי לחדש את התאים עם המדיום עד שהמושבות נוצרות. אם התרכובת של עניין הוא מעכב של tumorigenicity, זה יהיה לדכא את צמיחת התאים וכתוצאה מכך כמה מושבות בבארות. בפרוטוקול הבא, נבצע בדיקה של היווצרות מושבת אגר רכה כדי לחקור את ההשפעה של מעכבי PADI על הגידוליות של תאי סרטן השד.
התחל הליך זה על ידי הכנת 3% 2-הידרוקסיאתיל agarose. לתוך בקבוק זכוכית נקי ויבש 100 מיליליטר, להוסיף 0.9 גרם של 2-hydroxyethyl agarose ואחריו 30 מיליליטר של מים מזוקקים. מיקרוגל את התערובת במשך 15 שניות בעדינות מערבולת. חזור על שלב זה עד אבקת agarose מתמוסס לחלוטין. לאחר מכן, autoclave את הפתרון המכיל בקבוק במשך 15 דקות.
אפשרו לתמיסת ההתעוררות להתקרר לטמפרטורת החדר לפני המשך השימוש. מחממים מראש כמה פיפטות של 5 מיליליטר ו-10 מיליליטר באינקובטור של 37 מעלות צלזיוס כדי למנוע מהאגרוז להתגבש בפיפט בעת הטיפול. לשחרר חלקית את מכסה הבקבוק ומיקרוגל את הפתרון מראש 3% 2-hydroxyethyl agarose במשך 15 שניות. ואז בעדינות מערבולת הפתרון ומיקרוגל במשך 15 שניות נוספות.
היזהר בעת מערבולת פתרון agarose כי הפתרון עולה כאשר נחשף לאוויר יכול לשפוך מעל. אם יש שאריות ג'ל מוצק בבקבוק, מיקרוגל עוד כמה שניות. שמור את הבקבוק המכיל את הפתרון agarose באמבט מים 45 מעלות צלזיוס בשלבים הבאים כדי למנוע את הפתרון agarose מלהתמצק בטרם עת.
לאחר מכן, להעביר 12 מיליליטר של מדיה מחוממת באמצעות פיפטות מחוממים מראש לתוך צינור חרוט סטרילי 50 מיליליטר. מיד להוסיף שלושה מיליליטר של תמיסת 3% agarose בעדינות להפוך את הצינור חרוט לערבב את agarose עם התקשורת. לאחר מכן בעדינות להוסיף שני מיליליטר של תערובת זו לתוך כל באר של צלחת תרבות שש באר מבלי ליצור כל בועות אוויר. הדגירה את צלחת התרבות שש באר אופקית על משטח שטוח בארבע מעלות צלזיוס במשך שעה אחת כדי לאפשר לתערובת להתגבש.
לאחר התערובת מתגבשת, מניחים את הצלחת לתוך אינקובטור 37 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות. השכבה התחתונה מוכנה כעת לשימוש.
היבט קשה של הליך זה הוא לוודא כי כל התאים מופצים באופן שווה וכי ג'ל agarose נמס לא להתמצק לפני תוספת לכל באר, כדי להבטיח כי התאים מעורבבים בתקשורת לפני הוספת ג'ל agarose נוזלי. בנוסף פיפטות הם מראש מחומם מראש, כדי למנוע את הפתרונות של התגבשות בעת הטיפול.
כדי להכין את התא המכיל שכבה, תחילה לנסות MCF10DCIS תאים לדלל אותם לריכוז תאים של 40,000 תאים למיליליטר. ואז לקחת שמונה מיליליטר של מדיה באמצעות פיפטות מחוממים מראש, ולהעביר לתוך צינור חרוט סטרילי 50 מיליליטר. מיד להוסיף שני מיליליטר של 3% agarose לצינור חרוט, בעדינות להפוך לערבב את agarose עם התקשורת. הימנע מיצירת בועות.
לאחר מכן, קח שני מיליליטרים של התאים ולטפל בהם עם שני מיקרומולאר BB-כלור-amidine ב DMSO, או DMSO לבד כמו הפקד. לאחר הטיפול, מערבבים את התאים עם 0.6% agarose בדילול אחד לאחד כדי להפוך את הריכוז הסופי של מיקרומולאר אחד BB-כלור-amidine. ואז לקחת מיליליטר אחד של תערובת תא agarose בעדינות להוסיף על השכבה התחתונה של צלחת תרבות שש באר.
מניחים את צלחת התרבות שש באר אופקית על משטח שטוח ב 4 מעלות צלזיוס לפחות 15 דקות כדי לאפשר את השכבה העליונה להתמצק. לאחר שהתערובת מתגבשת, מניחים את הצלחת באינקובטור של 37 מעלות צלזיוס במשך שבוע לפני הוספת שכבת ההאכלה. התחל הכנת שכבת האכלה על ידי microwaving את הפתרון מראש 3% 2-hydroxyethyl agarose כמו קודם, ו equilibrating בקבוק פתרון agarose באמבט מים 45 מעלות צלזיוס.
מערבבים מיליליטר אחד של 3% פתרון agarose עם תשעה מיליליטר של מדיה חמה לתוך צינור חרוט 50 מיליליטר, בעדינות להפוך לערבב את agarose עם התקשורת. הימנע מיצירת בועות אוויר. לאחר טיפול בתערובת עם BB-כלור-amidine, בעדינות להוסיף מיליליטר אחד של התערובת לתוך כל באר של צלחת תרבות שש באר המכיל את השכבות התחתונות והרכות. לאחר מכן מניחים את צלחת התרבות שש באר אופקית על משטח שטוח ב 4 מעלות צלזיוס לפחות 15 דקות כדי לאפשר את התערובת להתמצק.
לאחר ששכבת ההזנה מתגבשת, מניחים את הצלחת באינקובטור של 37 מעלות צלזיוס. חזור על הליך האכלה זה מדי שבוע על ידי כיסוי מיליליטר אחד של 0.3% פתרון טיפול בינוני agarose על שכבת ההזנה הקיימת כדי לחדש את התאים עם מדיה חדשה עד היווצרות המושבה נצפתה.
