Soft Agar Colony Formation Assay: En metode for å teste effekter av nye forbindelser på kreftcelleproliferasjon

Til å begynne med, ta en passende konsentrasjon av smeltet agarose i et konisk rør og legg til ønsket mengde varmt kulturmedium til det. Inverter forsiktig for å blande innholdet. Tilsett denne blandingen i hver brønn av en seksbrønnsplate, og la den størkne. Dette er det nederste laget. Deretter behandler kreftceller med forbindelsen av interesse og legger til den nødvendige konsentrasjonen av agarose.

Hell nå denne blandingen som inneholder ønsket antall celler per milliliter i hver brønn. Dette er et celleholdig lag. Når mediet størkner, inkuberer du platen ved 37 grader Celsius i en uke. Forbered et materlag ved å blande agarose til mediet og supplere denne blandingen med forbindelsen av interesse. Legg forsiktig dette materlaget i hver brønn, la det størkne og inkubere platen ved 37 grader Celsius.

Gjenta denne fôringsprosedyren ukentlig for å etterfylle cellene med mediet til koloniene dannes. Hvis forbindelsen av interesse er en hemmer av tumorigenicitet, vil det undertrykke cellevekst som resulterer i få kolonier i brønnene. I følgende protokoll vil vi utføre en myk agarkoloniformasjonsanalyse for å studere effekten av PADI-hemmere på tumorogenisiteten til brystkreftceller.

Begynn denne prosedyren ved å forberede 3% 2-hydroksyetyl agarose. I en ren, tørr 100 milliliter glassflaske, tilsett 0,9 gram 2-hydroksyetyl agarose etterfulgt av 30 milliliter destillert vann. Mikrobølgeovn blandingen i 15 sekunder og virvle forsiktig. Gjenta dette trinnet til agarosepulveret er helt oppløst. Deretter autoklaverer løsningen som inneholder flaske i 15 minutter.

La agaroseløsningen avkjøles til romtemperatur før videre bruk. Forvarm flere fem milliliter og 10 milliliter pipetter i en 37 grader Celsius inkubator for å forhindre at agarose størkner i pipetten ved håndtering. Løsne flaskelokket delvis og mikrobølgeovn den ferdiglagde 3% 2-hydroksyetyl agarose oppløsningen i 15 sekunder. Virvle deretter løsningen og mikrobølgeovnen forsiktig i ytterligere 15 sekunder.

Vær forsiktig når du virvler agaroseløsningen fordi løsningen stiger opp når den utsettes for luft og kan smitte over. Hvis det er gjenværende solid gel i flasken, mikrobølgeovn i noen sekunder til. Oppbevar flasken som inneholder agaroseoppløsningen i et 45 graders Celsius vannbad i de neste trinnene for å forhindre at agaroseløsningen størkner for tidlig.

Deretter overfører du 12 milliliter varme medier ved hjelp av de forvarmede pipettene til et sterilt konisk rør på 50 milliliter. Tilsett umiddelbart tre milliliter av 3% agarose-løsningen og inverter forsiktig det koniske røret for å blande agarose med media. Tilsett deretter forsiktig to milliliter av denne blandingen i hver brønn av en seks-brønns kulturplate uten å danne noen luftbobler. Inkuber seksbrønns kulturplaten horisontalt på en flat overflate ved fire grader Celsius i en time for å la blandingen størkne.

Etter at blandingen størkner, legg platen i en 37 grader Celsius inkubator i 30 minutter. Det nederste laget er nå klart til bruk.

Et vanskelig aspekt ved denne prosedyren er å sørge for at alle celler fordeles likt og at smeltet agarose gel ikke størkner før tillegg til hver brønn, for å sikre at cellene blandes i media før du tilsetter flytende agarose gel. I tillegg er pipettene forhåndsvarmet på forhånd for å unngå at løsningene størkner under håndtering.

For å forberede cellen som inneholder laget, må du først prøve å utnytte MCF10DCIS-celler og fortynne dem til en cellekonsentrasjon på 40 000 celler per milliliter. Ta deretter åtte milliliter medier ved hjelp av forvarmede pipetter, og overfør til et sterilt 50 milliliter konisk rør. Tilsett umiddelbart to milliliter på 3% agarose til det koniske røret, og inverter forsiktig for å blande agarose med media. Unngå å danne noen bobler.

Deretter tar du to milliliter av cellene og behandler dem med to mikromolar BB-klor-amidine i DMSO, eller DMSO alene som kontroll. Etter behandling blander du cellene med en 0,6% agarose i en en til en fortynning for å lage en endelig konsentrasjon av en mikromolar BB-klor-amidine. Ta deretter en milliliter av celle-agarose-blandingen og legg forsiktig til bunnlaget på seksbrønns kulturplaten.

Plasser seksbrønns kulturplaten horisontalt på en flat overflate ved fire grader Celsius i minst 15 minutter for å la topplaget størkne. Etter at blandingen størkner, legg platen i en 37 grader Celsius inkubator i en uke før du legger til fôringslaget. Begynn å mate lagforberedelse ved å mikrowaving den ferdiglagde 3% 2-hydroksyetyl agarose løsningen som før, og likevekte agarose løsning flasken i en 45 grader Celsius vannbad.

Bland en milliliter 3% agarose løsning med ni milliliter varme medier i et 50 milliliter konisk rør, og inverter forsiktig for å blande agarose med media. Unngå å danne luftbobler. Etter å ha behandlet blandingen med BB-klor-amidine, tilsett forsiktig en milliliter av blandingen i hver brønn av den seks-brønns kulturplaten som inneholder bunnen og myke lag. Plasser deretter seksbrønns kulturplaten horisontalt på en flat overflate ved fire grader Celsius i minst 15 minutter for å la blandingen størkne.

Etter at materlaget størkner, plasser platen i en 37 grader Celsius inkubator. Gjenta denne fôringsprosedyren ukentlig ved å legge over en milliliter 0,3% agarose middels behandlingsløsning på det eksisterende materlaget for å fylle opp cellene med nye medier til kolonidannelse er observert.