Soft Agar Colony Formation Assay: En metod för att testa effekter av nya föreningar på cancercellsproliferation

1. Beredning av 3% 2-Hydroxyetyl agaros

1. Tillsätt 0,9 g 2-hydroxietylagarosa (Agarose VII) följt av 30 ml destillerat vatten i en ren, torr 100 ml glasflaska.
2. Mikrovåg blandningen i 15 sekunder och snurra försiktigt. Upprepa detta steg minst tre gånger tills agarospulvret helt löses upp.
3. Spara den lösningshaltiga flaskan automatiskt i 15 minuter.
4. Låt agaroslösningen svalna till RT innan den används vidare. Lagra lösningen på RT.

2. Beredning av bottenskiktet: 0,6% Agarose Gel

1. Förvärm flera 5 ml och 10 ml pipetter i en inkubator på 37 °C för att förhindra att agaros stelna i pipetten vid hantering.
2. Lossa delvis flasklocket och mikrovågsugnen den förgjorda 3% 2-hydroxyetylagarosalösningen i 15 sekunder. Snurra sedan försiktigt lösningen och mikrovågsugnen i ytterligare 15 sekunder.
   VARNING: Var försiktig när du virvlar agarosalösningen eftersom lösningen stiger upp när den utsätts för luft och kan spilla över.
3. Om det finns kvarvarande fast gel i flaskan, mikrovågsugn i några sekunder till.
4. Förvara flaskan som innehåller agaroslösningen i ett vattenbad på 45 °C under nästa steg för att förhindra att agaroslösningen stelnar i förtid.
5. Varm MCF10DCIS media i ett 37 °C vattenbad.
   OBS: MCF10DCIS media består av DMEM/F12, 5% hästserum, 5% penicillin streptomycin.
6. Överför 3 ml av 3% agaroslösningen med de förvärmda pipetterna till ett sterilt 50 ml koniskt rör.
7. Tillsätt omedelbart 12 ml varmt MCF10DCIS-medium och vänd försiktigt det koniska röret för att blanda agarosen med mediet. Försök att inte bilda några bubblor eftersom det kommer att störa koloniräkningen senare.
8. Tillsätt försiktigt 2 ml av denna blandning i varje brunn på en 6-brunns odlingsplatta utan att bilda några luftbubblor.
9. Inkubera 6-brunns odlingsplattan horisontellt på en plan yta vid 4 °C i 1 timme så att blandningen kan stelna.
10. När blandningen stelnat, placera plattan i en 37 °C inkubator i 30 min. Det nedre lagret är nu klart att användas.

3. Beredning av det cellinnehållande skiktet: 0,3% Agarose Gel

1. Trypsinize MCF10DCIS celler och späd dem till en cellkoncentration på 4 x 10⁴ /ml.
2. Ta 2 ml av 3% agarose med förvärmda pipetter och överför till ett sterilt 50 ml koniskt rör.
3. Tillsätt omedelbart 8 ml MCF10DCIS-media i det koniska röret och vänd försiktigt för att blanda agarosen med mediet. Undvik att bilda några bubblor.
4. Ta 2 ml AV MCF10DCIS-cellerna (4 x 10⁴ /ml) och behandla med BB-CLA (0 μM (DMSO) eller 1 μM).
5. Blanda cellerna med 0,6% agaros i en utspädning på 1:1.
6. Ta 1 ml av cellagarosblandningen och tillsätt försiktigt på bottenskiktet på 6-brunns odlingsplattan (2 x 10⁴ celler/ml).
7. Placera 6-brunns odlingsplattan horisontellt på en plan yta vid 4 °C i minst 15 minuter så att det övre lagret stelnat.
8. När blandningen stelnat, placera plattan i en 37 °C inkubator i en vecka innan du lägger till matningsskiktet.

4. Beredning av matarskiktet: 0,3% Agarose Gel

1. Mikrovåg den förgjorda 3% 2-Hydroxyethyl agarose lösningen i 15 sek. snurra försiktigt lösningen och mikrovågsugnen i ytterligare 15 sekunder.
2. Balansera agaroslösningsflaskan i ett vattenbad på 45 °C.
3. Värm MCF10DCIS-media i ett 37 °C vattenbad.
4. Blanda 1 ml 3% agaroslösning med 9 ml varmt MCF10DCIS-medium i ett 50 ml koniskt rör och vänd försiktigt för att blanda agarosen med mediet. Undvik att bilda luftbubblor.
5. Behandla blandningen med BB-CLA (0 μM (DMSO) eller 1 μM).
6. Tillsätt försiktigt 1 ml av denna blandning (utan att bilda bubblor) i varje brunn på 6-brunns odlingsplattan som innehåller botten och mjuka lager.
7. Placera 6-brunns odlingsplattan horisontellt på en plan yta vid 4 °C i minst 15 minuter så att blandningen kan stelna.
8. När matarskiktet stelnat placerar du plattan i en inkubator på 37 °C.
9. Upprepa denna utfodringsprocedur varje vecka genom att överlagra 1 ml 0,3% agaros/medium/behandlingslösning på det befintliga matarskiktet för att fylla på cellerna med nya medier tills kolonibildning observeras.
   OBS: Agar i de mjuka och matarskikten är mycket mjuk och därför kommer de tillsatta näringsämnena från matarskiktet lätt att sprida sig till det cellinnehållande skiktet för att nå cellerna.