Encyclopedia of Experiments: Cancer Research
Se requiere una suscripción a JoVE para ver este contenido. Inicie sesión o comience su prueba gratuita.
Transcript
Please note that all translations are automatically generated.
Başlamak için, konik bir tüpte uygun bir erimiş agarose konsantrasyonu alın ve ona istenen miktarda sıcak kültür ortamı ekleyin. İçeriği karıştırmak için yavaşça ters çevirin. Bu karışımı altı kuyulu bir tabağın her kuyusuna ekleyin ve katılaşmasını bırakın. Bu alt katman. Daha sonra, kanser hücrelerini ilgi çekici bileşikle tedavi edin ve gerekli agarose konsantrasyonu ekleyin.
Şimdi, mililitre başına istenen sayıda hücre içeren bu karışımı her kuyuya dökün. Bu hücre içeren bir katmandır. Orta katılaştıktan sonra, plakayı bir hafta boyunca 37 santigrat derecede kuluçkaya yatırın. Agarose'yi ortama karıştırarak bir besleyici tabakası hazırlayın ve bu karışımı ilgi çekici bileşikle destekleyin. Bu besleyici tabakasını her kuyuya yavaşça ekleyin, katılaşmasını bırakın ve plakayı 37 santigrat derecede kuluçkaya bırakın.
Koloniler oluşana kadar hücreleri ortamla doldurmak için bu besleme prosedürünü haftalık olarak tekrarlayın. İlgi bileşiği tümörojenikliğin bir inhibitörü ise, kuyularda az sayıda koloni ile sonuçlanan hücrelerin büyümesini baskılayacaktır. Aşağıdaki protokolde PADI inhibitörlerinin meme kanseri hücrelerinin tümörojenliği üzerindeki etkisini incelemek için yumuşak bir agar kolonisi oluşumu tahlilini gerçekleştireceğiz.
% 3 2-hidroksiyetil agarose hazırlayarak bu prosedüre başlayın. Temiz, kuru 100 mililitre cam şişeye 0,9 gram 2 hidroksiyetil agarose ve ardından 30 mililitre damıtılmış su ekleyin. Karışımı 15 saniye mikrodalgaya koyun ve hafifçe döndürün. Agarose tozu tamamen çözünene kadar bu adımı tekrarlayın. Daha sonra, şişe içeren çözeltiyi 15 dakika boyunca otoklavlayın.
Daha fazla kullanmadan önce agarose çözeltisinin oda sıcaklığına soğumasını bekleyin. Agarose'un elleçleme sırasında pipette katılaşmasını önlemek için 37 santigrat derecelik bir inkübatörde birkaç beş mililitre ve 10 mililitre pipet önceden ısıtın. Şişe kapağını kısmen gevşetin ve önceden yapılmış% 3 2 hidroksetil agarose çözeltisini 15 saniye boyunca mikrodalgaya koyun. Daha sonra çözeltiyi ve mikrodalgayı 15 saniye daha hafifçe döndürün.
Agarose çözeltisini döndürürken dikkatli olun, çünkü çözelti havaya maruz kaldığında yükselir ve üzerine dökülebilir. Şişede artık katı jel varsa, birkaç saniye daha mikrodalga fırınlayın. Agarose çözeltisinin zamanından önce katılaşmasını önlemek için sonraki adımlar sırasında agarose çözeltisini içeren şişeyi 45 santigrat derecelik bir su banyosunda tutun.
Daha sonra, önceden ısıtılmış pipetleri kullanarak 12 mililitre ısıtılmış ortamı steril 50 mililitre konik bir tüpe aktarın. Hemen% 3 agarose çözeltisinin üç mililitresini ekleyin ve agarose'u medya ile karıştırmak için konik tüpü hafifçe ters çevirin. Daha sonra herhangi bir hava kabarcığı oluşturmadan altı kuyulu bir kültür plakasının her kuyusuna bu karışımdan iki mililitre hafifçe ekleyin. Altı kuyulu kültür plakasını, karışımın katılaşmasını sağlamak için bir saat boyunca dört santigrat derecede düz bir yüzeyde yatay olarak kuluçkaya yatırın.
Karışım katılaştıktan sonra, plakayı 30 dakika boyunca 37 santigrat derecelik bir inkübatöre yerleştirin. Alt katman artık kullanıma hazırdır.
Bu prosedürün zor bir yönü, tüm hücrelerin eşit olarak dağıtıldığından ve erimiş agarose jelinin her kuyuya eklenmeden önce katılaşmamasını sağlamak, sıvı agarose jelini eklemeden önce hücrelerin ortamda karıştırılmasını sağlamaktır. Ayrıca pipetler, çözeltilerin elleçleme yaparken katılaşmasını önlemek için önceden ısıtılır.
Katman içeren hücreyi hazırlamak için, önce MCF10DCIS hücrelerini deneyin ve mililitre başına 40.000 hücrelik bir hücre konsantrasyonuna seyreltin. Daha sonra önceden ısıtılmış pipetler kullanarak sekiz mililitre medya alın ve steril 50 mililitrelik konik bir tüpe aktarın. Konik tüpe hemen iki mililitre% 3 agarose ekleyin ve agarose'u medya ile karıştırmak için hafifçe ters çevirin. Herhangi bir kabarcık oluşturmaktan kaçının.
Daha sonra, hücrelerin iki mililitresini alın ve DMSO'da iki mikromoler BB-klor-amidin veya kontrol olarak tek başına DMSO ile tedavi edin. Tedaviden sonra, hücreleri bir mikromolar BB-klor-amidin son konsantrasyonunu yapmak için bire bir seyreltmede% 0.6 agarose ile karıştırın. Daha sonra hücre-agarose karışımından bir mililitre alın ve altı kuyu kültür plakasının alt tabakasına hafifçe ekleyin.
Üst tabakanın katılaşmasını sağlamak için altı kuyulu kültür plakasını en az 15 dakika boyunca dört santigrat derecede düz bir yüzeye yatay olarak yerleştirin. Karışım katılaştıktan sonra, besleme tabakasını eklemeden önce tabağı bir hafta boyunca 37 santigrat derecelik bir inkübatöre yerleştirin. Önceden yapılmış% 3'lük 2 hidroksiyetil agarose çözeltisini daha önce olduğu gibi mikrowaving ve agarose çözelti şişesini 45 santigrat derecelik bir su banyosunda dengeleyerek besleme tabakası hazırlamaya başlayın.
%3'lük bir mililitre agarose çözeltisini dokuz mililitre sıcak ortamla 50 mililitrelik konik bir tüpe karıştırın ve agaroseyu medyayla karıştırmak için hafifçe ters çevirin. Hava kabarcıkları oluşturmaktan kaçının. Karışımı BB-klor-amidin ile tedavi ettikten sonra, alt ve yumuşak katmanları içeren altı kuyulu kültür plakasının her kuyusuna bir mililitre karışım ekleyin. Daha sonra altı kuyulu kültür plakasını, karışımın katılaşmasını sağlamak için en az 15 dakika boyunca dört santigrat derecede düz bir yüzeye yatay olarak yerleştirin.
Besleyici tabakası katılaştıktan sonra, plakayı 37 santigrat derecelik bir inkübatöre yerleştirin. Koloni oluşumu gözlenene kadar hücreleri yeni ortamla yenilemek için mevcut besleyici tabakasına% 0,3 agarose orta tedavi çözeltisinin bir mililitresini bindirerek bu besleme prosedürünü haftalık olarak tekrarlayın.
