Encyclopedia of Experiments: Cancer Research
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まず、円錐状のチューブに溶けたアガロースの適切な濃度を取り、それに温かい培養培地の所望の量を加えます。内容を混ぜ合わせてそっと反転します。この混合物を6ウェルプレートの各ウェルに加え、固化させます。これが一番下のレイヤーです。次に、目的の化合物を持つ癌細胞を治療し、アガロースの必要な濃度を追加します。
さて、各ウェルにミリリットル当たりの所望の数の細胞を含むこの混合物を注ぎます。これはセルを含むレイヤーです。中程度が固まったら、1週間摂氏37度でプレートをインキュベートします。培地にアガロースを混合することによってフィーダー層を準備し、目的の化合物でこの混合物を補完.このフィーダー層を各ウェルにそっと加え、固め、プレートを摂氏37度でインキュベートします。
コロニーが形成されるまで培地で細胞を補充するために毎週この摂食手順を繰り返す。目的の化合物が腫瘍原性の阻害剤である場合、それはウェル内の少数のコロニーをもたらす細胞の増殖を抑制する。以下のプロトコルでは、PADI阻害剤が乳癌細胞の腫瘍形成性に及ぼす影響を研究するために、軟 寒天 コロニー形成アッセイを行う。
この手順は、3%2-ヒドロキジエチルアガロースを調製することによって開始する。清潔で乾燥した100ミリリットルのガラス瓶に、0.9グラムの2-hydroxyethylアガロースを加え、続いて蒸留水30ミリリットルを加えます。混合物を15秒間電子レンジし、そっと渦巻きます。アガロース粉末が完全に溶解するまで、このステップを繰り返します。次に、ボトルを含む溶液を15分間オートクレーブする。
アガロース溶液を室温まで冷却してから使用してください。取り扱い時にアガロースがピペットで固化するのを防ぐために、37°Cインキュベーターで数5ミリリットルと10ミリリットルのピペットを事前に温めます。ボトル蓋を部分的に緩め、あらかじめ作られた3%の2-ヒドロキエチルアガロース溶液を15秒間緩めます。その後、溶液と電子レンジをさらに15秒間そっと旋回します。
アガロース溶液を渦巻くときは、空気に曝露すると溶液が立ち上がり、こぼれ落ちる可能性があるため、注意してください。ボトルに残留固形ゲルがある場合は、電子レンジをさらに数秒間使用する。アガロース溶液が早期に固まりないように、次のステップで45°Cの水浴にアガロース溶液を含むボトルを保管してください。
次に、あらかじめ温めたピペットを使用して12ミリリットルの温めた培地を無菌50ミリリットルの円錐管に移す。直ちに3%アガロース溶液の3ミリリットルを加え、円錐管を穏やかに反転してアガロースを培地と混合する。その後、気泡を形成することなく、6ウェル培養プレートの各ウェルにこの混合物の2ミリリットルを静かに追加します。6ウェル培養プレートを摂氏4度の平らな表面に水平に1時間インキュベートし、混合物を固化させます。
混合物を固めた後、30分間摂氏37度のインキュベーターにプレートを置きます。下層を使用する準備ができました。
この手順の難しい側面は、液体アガロースゲルを添加する前に、細胞が培地に混合されていることを確認するために、すべての細胞が均等に分布し、溶融アガロースゲルが各ウェルに添加する前に固化しないことを確認することです。さらにピペットは取扱い中の解決が固まるのを避けるために事前に温められます。
細胞含有層を調製するために、まずMCF10DCIS細胞をトリプシン化し、1ミリリットル当たり40,000細胞の細胞濃度に希釈する。その後、事前に温めたピペットを使用して8ミリリットルの培地を取り、無菌50ミリリットルの円錐管に移します。直ちに3%アガロースの2ミリリットルを円錐管に加え、穏やかに反転してアガロースを培地と混合する。気泡を形成しないでください。
次に、2ミリリットルの細胞を取り、DMSO内の2つの小臼歯BB-クロアミド、またはDMSO単独でコントロールとしてそれらを処理する。処理後、細胞を0.6%のアガロースを1~1希釈で混合し、1マイクロモルBB-クロアミドの最終濃度を作ります。その後、細胞アガロース混合物の1ミリリットルを取り、穏やかに6ウェル培養プレートの底層に追加します。
6ウェルの培養プレートを摂氏4度の平らな表面に少なくとも15分間水平に置き、最上層を固めます。混合物を固めた後、給餌層を加える前に1週間、プレートを摂氏37度のインキュベーターに入れます。あらかじめ作られた3%の2-hydroxyethylアガロース溶液を以前のようにマイクロウェーブし、45°Cの水浴でアガロース溶液ボトルを平衡化することにより、供給層調製を開始する。
3%のアガロース溶液と9ミリリットルの温かい媒体を50ミリリットルの円錐チューブに1ミリリットル混ぜ、穏やかに反転してアガロースを培地と混合する。気泡を形成しないでください。BB-クロルアミドで混合物を処理した後、底と柔らかい層を含む6ウェル培養プレートの各ウェルに混合物の1ミリリットルを静かに追加します。その後、6ウェル培養プレートを摂氏4度の平らな表面に少なくとも15分間水平に置き、混合物を固めます。
フィーダー層が固化した後、プレートを摂氏37度のインキュベーターに入れます。コロニー形成が観察されるまで、この摂食手順を毎週、0.3%アガロース培地処理液を既存のフィーダー層に重ね、細胞に新しい培地を補充することによって繰り返す。
