Ensayo de formación de colonias de agar blando: un método para probar los efectos de los nuevos compuestos sobre la proliferación de células cancerosas

Para empezar, tome una concentración adecuada de agarose fundida en un tubo cónico y agregue una cantidad deseada de medio de cultivo cálido a él. Invierta suavemente para mezclar el contenido. Agregue esta mezcla en cada pozo de una placa de seis pozos y deje que se solidifique. Esta es la capa inferior. A continuación, tratar las células cancerosas con el compuesto de interés y añadir la concentración requerida de agarose.

Ahora, vierta esta mezcla que contiene el número deseado de células por mililitro en cada pozo. Esta es una capa que contiene células. Una vez que el medio se solidifique, incubar la placa a 37 grados Celsius durante una semana. Preparar una capa alimentadora mezclando agarose al medio y complementar esta mezcla con el compuesto de interés. Agregue suavemente esta capa alimentador en cada pozo, déjela solidificar e incubar la placa a 37 grados centígrados.

Repita este procedimiento de alimentación semanalmente para reponer las células con el medio hasta que se formen colonias. Si el compuesto de interés es un inhibidor de la tumorigenicidad, suprimirá el crecimiento de las células resultando en pocas colonias en los pozos. En el siguiente protocolo, realizaremos un ensayo de formación de colonias de agar suave para estudiar el efecto de los inhibidores padi en la tumorigenicidad de las células de cáncer de mama.

Comience este procedimiento preparando 3% 2-hidroxietil agarose. En una botella de vidrio limpia y seca de 100 mililitros, agregue 0,9 gramos de agarose de 2 hidroxietil seguidos de 30 mililitros de agua destilada. Microondas la mezcla durante 15 segundos y remolino suavemente. Repita este paso hasta que el polvo de agarose se disuelva por completo. A continuación, autoclave la solución que contiene botella durante 15 minutos.

Deje que la solución de agarose se enfríe a temperatura ambiente antes de su uso posterior. Precalentar varias pipetas de cinco mililitros y 10 mililitros en una incubadora de 37 grados Celsius para evitar que la agarose se solidifique en la pipeta al manipularla. Afloje parcialmente la tapa de la botella y el microondas la solución prefaseada de 3% 2 hidroxietil agarose durante 15 segundos. A continuación, gire suavemente la solución y el microondas durante otros 15 segundos.

Tenga cuidado al girar la solución de agarose porque la solución se eleva cuando se expone al aire y puede derramarse. Si hay gel sólido residual en la botella, microondas durante unos segundos más. Mantenga la botella que contiene la solución de agarose en un baño de agua celsius de 45 grados durante los siguientes pasos para evitar que la solución de agarose se solidifique prematuramente.

A continuación, transfiera 12 mililitros de medios calentados utilizando las pipetas precalentadas en un tubo cónico estéril de 50 mililitros. Agregue inmediatamente tres mililitros de la solución de agarose del 3% e invierta suavemente el tubo cónico para mezclar la agarose con los medios. A continuación, agregue suavemente dos mililitros de esta mezcla en cada pozo de una placa de cultivo de seis pozos sin formar burbujas de aire. Incubar la placa de cultivo de seis pozos horizontalmente sobre una superficie plana a cuatro grados centígrados durante una hora para permitir que la mezcla se solidifique.

Después de que la mezcla se solidifique, coloque la placa en una incubadora de 37 grados Celsius durante 30 minutos. La capa inferior ya está lista para su uso.

Un aspecto difícil de este procedimiento es asegurarse de que todas las células se distribuyen por igual y que el gel de agarose derretido no se solidifique antes de la adición a cada pozo, para asegurarse de que las células se mezclan en los medios antes de añadir el gel de agarose líquido. Además, las pipetas se calientan previamente para evitar que las soluciones se solidifiquen durante la manipulación.

Para preparar la célula que contiene la capa, primero intente probar las células MCF10DCIS y diluirlas a una concentración celular de 40.000 células por mililitro. A continuación, tome ocho mililitros de medios usando pipetas precalentadas, y transfiéralo a un tubo cónico estéril de 50 mililitros. Agregue inmediatamente dos mililitros de 3% de agarose al tubo cónico, e invierta suavemente para mezclar la agarose con los medios. Evite formar burbujas.

A continuación, tomar dos mililitros de las células y tratarlos con dos micromolar BB-cloro-amidina en DMSO, o DMSO solo como el control. Después del tratamiento, mezcle las células con una agarose del 0,6% en una dilución de uno a uno para hacer una concentración final de un micromolar BB-clor-amidina. A continuación, tome un mililitro de la mezcla de agarose celular y agregue suavemente en la capa inferior de la placa de cultivo de seis pozos.

Coloque la placa de cultivo de seis pozos horizontalmente sobre una superficie plana a cuatro grados Celsius durante al menos 15 minutos para permitir que la capa superior se solidifique. Después de que la mezcla se solidifique, coloque el plato en una incubadora de 37 grados Celsius durante una semana antes de agregar la capa de alimentación. Comience a alimentar la preparación de capas mediante microwaving la solución prefaseada de 2 hidroxietil agarose como antes, y aequilibrando la botella de solución de agarose en un baño de agua de 45 grados Celsius.

Mezcle un mililitro de solución de agarose del 3% con nueve mililitros de medios cálidos en un tubo cónico de 50 mililitros e invierta suavemente para mezclar la agarose con los medios. Evite formar burbujas de aire. Después de tratar la mezcla con BB-cloro-amidina, agregue suavemente un mililitro de la mezcla en cada pozo de la placa de cultivo de seis pozos que contiene la parte inferior y las capas blandas. Luego coloque la placa de cultivo de seis pozos horizontalmente sobre una superficie plana a cuatro grados Celsius durante al menos 15 minutos para permitir que la mezcla se solidifique.

Después de que la capa alimentadora se solidifique, coloque la placa en una incubadora de 37 grados Celsius. Repita este procedimiento de alimentación semanalmente superponiendo un mililitro de solución de tratamiento medio de 0.3% de agarose en la capa alimentadora existente para reponer las células con nuevos medios hasta que se observe la formación de colonias.