Encyclopedia of Experiments: Cancer Research
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Comece colocando um pedaço de cera óssea em duas placas de cultura celular rotuladas como teste e controle. Pipeta uma quantidade apropriada de bioluminescência expressando células cancerígenas de mama em cada centro de placas e incubar as placas por uma duração específica para auxiliar a fixação celular. Coloque uma pequena explanta óssea na cera óssea na placa de teste e fixe-a aplicando pressão.
Despeje lentamente um meio de cultura celular com soro bovino fetal, um suplemento de crescimento, para cada lado da placa para submergir a explanta e incubar a 37 graus Celsius por uma duração específica. O tecido ósseo na placa de teste libera fatores solúveis, como citocinas e quinase SRC, que atraem células cancerígenas de mama, resultando em sua migração. Adicione um substrato a cada placa e coloque as placas em uma câmara de imagem de bioluminescência.
A célula cancerígena que expressa proteína bioluminescente oxida o substrato e emite luz. Quantifique a proliferação medindo o total de fótons emitidos por cada célula usando o software. As células cancerígenas na placa de teste devem proliferar mais rápido do que as células da placa de controle. No protocolo a seguir, vamos co-cultivar células cancerígenas de mama adjacentes às explantas ósseas do fêmur para medir a proliferação de células mamárias.
Para este experimento, prepare uma suspensão de células cancerígenas de mama com 100.000 células por 50 microliters de DMEM mais 10% FBS. Além disso, prepare os plugues de cera óssea para imobilizar os fragmentos ósseos. Usando as extremidades cortadas de uma ponta de micropipette, armazene os plugues em uma placa de petri. Em seguida, com fórceps transfira os plugues para uma placa de seis poços e usando uma luva estéril, pressione os plugues na posição das 12 horas.
Em seguida, pipeta 50 microliters da suspensão celular no centro de cada poço. Coloque a placa em uma incubadora de cultura tecidual por 45 minutos para promover o apego celular. Enquanto a placa incuba, extraia os fragmentos ósseos. Com as células presas à placa, coloque os fragmentos de tecido ósseo na cera óssea em 3 poços e pressione cada um usando o rongeur. Três poços sem fragmento servem como controles.
Em seguida, adicione lentamente cinco mililitros de DMEM mais 10% FBS à parede de cada poço. A cera óssea e os fragmentos ósseos não devem ser desalojados. Em seguida, incubar a cultura por 20 a 24 horas. No dia seguinte, imagem as células. Primeiro adicione 300 microgramas por mililitro de luciferina a cada poço e, em seguida, imagem imediatamente a placa com uma plataforma de imagem IVIS.
