Co-culminando células bc: culturando células cancerígenas de mama com fragmentos ósseos para estudar a proliferação de células cancerosas

1. Co-culminar células cancerígenas de mama adjacentes a fragmentos ósseos para medir a proliferação de células mamárias usando BLI

1. Antes do experimento, prepare uma suspensão contendo 2 x 10⁵ células cancerígenas de mama/50 μl, e prepare os plugues de cera óssea para imobilizar fragmentos ósseos na cultura. Corte uma ponta de micropipette P200 em 3 pedaços e use a extremidade estreita da maior peça de uma maneira "cortador de biscoitos" para cortar pequenos (~35 mg) pedaços de cera óssea. Use a extremidade larga da menor peça para ejetar os plugs de cera óssea em uma placa de Petri para armazenamento.
2. Coloque um pedaço de cera óssea na posição das 12 horas de cada poço e pressione suavemente para baixo com um dedo indicador de luvas estéril.
3. Pipeta 50 μl de suspensão celular contendo 1 x 10⁵ células cancerígenas de mama em DMEM-10% FBS + Pen-Strep no centro de cada poço de uma placa de 6 poços. (Alternativamente, células de sementes em um padrão disperso, se desejar.) Coloque a placa em uma incubadora de cultura de tecido de 37 °C por 45 minutos para promover a fixação celular.
4. Coloque 1 fragmento ósseo em 1 pedaço de cera óssea para cada poço experimental e aplique pressão suave com o rongeur para fixá-lo. Realize experimentos em triplicado de tal forma que 3 fragmentos ósseos de uma determinada amostra de THR sejam colocados nos três poços superiores, enquanto os três poços inferiores contêm cera óssea apenas como controles.
5. Usando uma pipeta de 5 ml, levemente e lentamente entregue 5 ml de DMEM-10% FBS ao lado de cada poço para evitar desalojar as células mamárias ou fragmentos ósseos. Coloque a placa em uma incubadora de cultura de tecido de 37 °C durante 20-24 horas.
6. Para realizar a bioluminescência (BLI) remova a placa da incubadora e adicione o substrato de luciferina (para alcançar uma concentração de 300 μg/ml) a cada poço. Imagem da placa imediatamente em uma Plataforma de Imagem IVIS usando os seguintes parâmetros: f-stop de 1, binning pequeno, tempo de exposição de 1 seg, nível D. Meça a intensidade do sinal de cada um, bem como o brilho médio (f-xatons/segundo/centímetro quadrado/steradian).
7. Use o software de imagem para definir Regiões de Interesse (ROI) para quantificar o brilho médio de todos os poços experimentais e de controle. Exporte valores médios de brilho para uma folha de Excel para executar estatísticas e gerar gráficos.