Encyclopedia of Experiments: Cancer Research
Se requiere una suscripción a JoVE para ver este contenido. Inicie sesión o comience su prueba gratuita.
Transcript
Please note that all translations are automatically generated.
Begin met het plaatsen van een stuk botwas in twee celkweekplaten met het label test en controle. Pipetteer een geschikte hoeveelheid bioluminescentie die borstkankercellen uitdrukt in elk plaatcentrum en incubeer de platen gedurende een specifieke duur om de celaanhechting te helpen. Plaats een kleine bot explant op de botwas in de testplaat en zet deze vast door druk uit te oefenen.
Giet langzaam een celkweekmedium met foetale runderserum, een groeisupplement, naar elke plaatzijde om de explant onder te dompelen en te incuberen bij 37 graden Celsius voor een specifieke duur. Het botweefsel in de testplaat geeft oplosbare factoren vrij, zoals cytokinen en SRC-kinase, die borstkankercellen aantrekken, wat resulteert in hun migratie. Voeg een substraat toe aan elke plaat en plaats de platen op een bioluminescentiebeeldvormingskamer.
De kankercel die bioluminescent eiwit uitdrukt oxideert het substraat en zendt licht uit. Kwantificeer de proliferatie door de totale fotonen te meten die door elke cel met behulp van de software worden uitgezonden. Kankercellen in de testplaat moeten zich sneller verspreiden dan de cellen in de controleplaat. In het volgende protocol zullen we borstkankercellen naast dijbeen explants co-culteren om de proliferatie van borstcellen te meten.
Bereid voor dit experiment een suspensie van borstkankercellen voor met 100.000 cellen per 50 microliter DMEM plus 10% FBS. Bereid bovendien pluggen van botwas voor voor het immobiliseren van de botfragmenten. Bewaar de stekkers in een petrischaaltje met behulp van de afgesneden uiteinden van een micropipetpunt. Breng vervolgens met een tang de stekkers over in een plaat met zes putten en druk met een steriele handschoen de stekkers in de stand van 12 uur.
Pipetteer vervolgens 50 microliters van de celsuspensie in het midden van elke put. Plaats de plaat gedurende 45 minuten in een weefselkweek-incubator om de celaanhechting te bevorderen. Terwijl de plaat incubeert, extraheert u de botfragmenten. Met de cellen bevestigd aan de plaat, plaats de botweefselfragmenten op de botwas in 3 putten en druk elk naar beneden met behulp van de rongeur. Drie putten zonder fragment dienen als besturing.
Voeg vervolgens langzaam vijf milliliter DMEM plus 10% FBS toe aan de wand van elke put. De botwas en botfragmenten mogen niet losgemaakt worden. Incubeer vervolgens de cultuur gedurende 20 tot 24 uur. De volgende dag, beeld de cellen. Voeg eerst 300 microgram luciferine per milliliter luciferine toe aan elke put en stel de plaat onmiddellijk in beeld met een IVIS imaging Platform.
