Encyclopedia of Experiments: Cancer Research
Se requiere una suscripción a JoVE para ver este contenido. Inicie sesión o comience su prueba gratuita.
Transcript
Please note that all translations are automatically generated.
Test ve kontrol olarak etiketlenmiş iki hücre kültürü plakasına bir parça kemik balmumu yerleştirerek başlayın. Pipet her plaka merkezinde meme kanseri hücrelerini ifade eden uygun miktarda biyolüminesans ve hücre bağlanmasına yardımcı olmak için plakaları belirli bir süre kuluçkaya yatırmak. Test plakasındaki kemik balmumuna küçük bir kemik eksplant yerleştirin ve basınç uygulayarak sabitleyin.
Eksplant'ı batırmak ve belirli bir süre için 37 santigrat derecede kuluçkaya yatırmak için her bir plaka tarafına bir büyüme takviyesi olan fetal sığır serumu ile bir hücre kültürü ortamı dökün. Test plakasındaki kemik dokusu, meme kanseri hücrelerini çeken sitokinler ve SRC kinaz gibi çözünür faktörleri serbest bırakır ve göçleriyle sonuçlanır. Her plakaya bir substrat ekleyin ve plakaları bir biyolüminesans görüntüleme odasına yerleştirin.
Biyolüminesan proteini ifade eden kanser hücresi substratı oksitler ve ışık yayar. Yazılımı kullanarak her hücrenin yaydığı toplam fotonları ölçerek çoğalma ölçün. Test plakasındaki kanser hücreleri kontrol plakasındaki hücrelerden daha hızlı çoğalmalıdır. Aşağıdaki protokolde, meme hücresi çoğalmasını ölçmek için uyluk kemiği eksplantlarına bitişik meme kanseri hücrelerini birlikte kültüre edeceğiz.
Bu deney için, 50 mikrolitre DMEM artı% 10 FBS başına 100.000 hücreli bir meme kanseri hücre süspansiyonu hazırlayın. Ek olarak, kemik parçalarını hareketsizleştirmek için kemik balmumu fişleri hazırlayın. Bir mikropipette ucun kesilmiş uçlarını kullanarak, fişleri bir petri kabında saklayın. Daha sonra asalar fişleri altı kuyulu bir tabağa aktarın ve steril bir eldiven kullanarak fişleri saat 12 pozisyonuna bastırın.
Daha sonra, hücre süspansiyonunun 50 mikrolitresini her kuyunun ortasına pipet. Hücre bağlanmasını teşvik etmek için plakayı 45 dakika boyunca bir doku kültürü inkübatörüne yerleştirin. Plaka inkübe olurken, kemik parçalarını çıkarın. Plakaya bağlı hücrelerle, kemik dokusu parçalarını 3 kuyuda kemik balmumuna yerleştirin ve rongeur kullanarak her birine bastırın. Parçasız üç kuyu kontrol görevi alır.
Ardından, her kuyunun duvarına yavaşça beş mililitre DMEM artı% 10 FBS ekleyin. Kemik cilası ve kemik parçaları yerinden çıkmamalı. Daha sonra kültürü 20 ila 24 saat kuluçkaya yatırın. Ertesi gün, hücreleri görüntüle. Önce her kuyuya mililitre luciferin başına 300 mikrogram ekleyin ve ardından plakayı hemen bir IVIS görüntüleme Platformu ile görüntüleyin.
