Co-coltivare cellule BC: coltivare cellule tumorali del seno con frammenti ossei per studiare la proliferazione delle cellule tumorali

Inizia posizionando un pezzo di cera ossea in due piastre di coltura cellulare etichettate come test e controllo. Pipettare una quantità appropriata di bioluminescenza che esprime le cellule tumorali del seno in ogni centro piastra e incubare le piastre per una durata specifica per aiutare l'attacco cellulare. Posizionare un piccolo osso esplant sulla cera ossea nella piastra di prova e fissarlo applicando pressione.

Versare lentamente un mezzo di coltura cellulare con siero bovino fetale, un integratore di crescita, su ciascun lato piastra per immergere l'espianto e incubare a 37 gradi Celsius per una durata specifica. Il tessuto osseo nella piastra di prova rilascia fattori solubili, come citochine e SRC chinasi, che attirano le cellule tumorali del seno, con conseguente migrazione. Aggiungere un substrato a ogni piastra e posizionare le piastre su una camera di imaging a bioluminescenza.

La cellula tumorale che esprime proteine bioluminescenti ossida il substrato ed emette luce. Quantificare la proliferazione misurando i fotoni totali emessi da ogni cella utilizzando il software. Le cellule tumorali nella piastra di prova dovrebbero proliferare più velocemente delle cellule nella piastra di controllo. Nel seguente protocollo, co-coltimo le cellule tumorali del seno adiacenti alle espianto ossee del femore per misurare la proliferazione delle cellule mammari.

Per questo esperimento, preparare una sospensione delle cellule tumorali del seno con 100.000 cellule per 50 microlitri di DMEM più 10% FBS. Inoltre, preparare tappi di cera ossea per immobilizzare i frammenti ossei. Utilizzando le estremità tagliate di una punta in micropipetta, conservare le spine in una piastra di Petri. Quindi con le forcep trasferire le spine in una piastra a sei pozza e utilizzando un guanto sterile, premere le spine nella posizione a ore 12.

Successivamente, pipetta 50 microlitri della sospensione cellulare al centro di ogni pozzo. Posizionare la piastra in un incubatore di coltura tissutale per 45 minuti per promuovere l'attacco cellulare. Mentre la piastra incuba, estrarre i frammenti ossei. Con le cellule attaccate alla piastra, posizionare i frammenti di tessuto osseo sulla cera ossea in 3 pozzi e premere ciascuno verso il basso usando il rongeur. Tre pozzi senza frammento fungono da controlli.

Successivamente, aggiungere lentamente cinque millilitri di DMEM più 10% FBS alla parete di ogni pozzo. La cera ossea e i frammenti ossei non devono essere spodesati. Quindi incubare la coltura per 20-24 ore. Il giorno dopo, immagini le celle. Prima aggiungere 300 microgrammi per millilitro di luciferina ad ogni pozzo, quindi mentre si immaginerà immediatamente la piastra con una piattaforma di imaging IVIS.