Encyclopedia of Experiments: Cancer Research
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Beginnen Sie, indem Sie ein Stück Knochenwachs in zwei Zellkulturplatten legen, die als Test und Kontrolle gekennzeichnet sind. Pipette eine angemessene Menge an Biolumineszenz, die Brustkrebszellen in jedem Plattenzentrum ausdrückt, und inkubieren Sie die Platten für eine bestimmte Dauer, um die Zellanhaftung zu unterstützen. Legen Sie eine kleine Knochenexplantation auf das Knochenwachs in die Testplatte und sichern Sie sie durch Druck.
Gießen Sie langsam ein Zellkulturmedium mit fetalem Rinderserum, einer Wachstumsergänzung, auf jede Plattenseite, um das Explant zu untertauchen und bei 37 Grad Celsius für eine bestimmte Dauer zu brüten. Das Knochengewebe in der Testplatte setzt lösliche Faktoren wie Zytokine und SRC-Kinase frei, die Brustkrebszellen anziehen, was zu ihrer Migration führt. Fügen Sie jeder Platte ein Substrat hinzu und legen Sie die Platten auf eine Biolumineszenz-Bildkammer.
Die Krebszelle, die biolumineszierendes Protein ausdrückt, oxidiert das Substrat und emittiert Licht. Quantifizieren Sie die Proliferation, indem Sie die Gesamtphotonen messen, die von jeder Zelle mit der Software emittiert werden. Krebszellen in der Testplatte sollten sich schneller vermehren als die Zellen in der Kontrollplatte. Im folgenden Protokoll werden wir Brustkrebszellen neben Oberschenkelknochenexplantieren mitkulturen, um die Proliferation von Brustzellen zu messen.
Für dieses Experiment bereiten Sie eine Brustkrebszellsuspension mit 100.000 Zellen pro 50 Mikroliter DMEM plus 10% FBS vor. Bereiten Sie außerdem Steckkerzen aus Knochenwachs für die Immobilisierung der Knochenfragmente vor. Mit den abgeschnittenen Enden einer Mikropipette-Spitze die Stecker in einer Petrischale aufbewahren. Dann mit Zangen übertragen Sie die Stecker in eine Sechs-Well-Platte und drücken Sie mit einem sterilen Handschuh die Stecker in die 12-Uhr-Position.
Als nächstes Pipette 50 Mikroliter der Zellsuspension in die Mitte jedes Brunnens. Legen Sie die Platte 45 Minuten lang in einen Inkubator der Gewebekultur, um die Zellanhaftung zu fördern. Während die Platte brütet, extrahieren Sie die Knochenfragmente. Mit den Zellen, die an der Platte befestigt sind, legen Sie die Knochengewebefragmente in 3 Brunnen auf das Knochenwachs und drücken Sie jede mit dem Rongeur nach unten. Drei Brunnen ohne Fragment dienen als Kontrollen.
Als nächstes fügen Sie langsam fünf Milliliter DMEM plus 10% FBS an die Wand jedes Brunnens. Die Knochenwachs- und Knochenfragmente dürfen nicht verdrängt werden. Dann inkubieren Sie die Kultur für 20 bis 24 Stunden. Bildnis der Zellen am nächsten Tag. Fügen Sie zunächst 300 Mikrogramm pro Milliliter Luziferin zu jedem Brunnen hinzu, und dann sofort die Platte mit einer IVIS-Bildplattform abbilden.
