Encyclopedia of Experiments: Cancer Research
Se requiere una suscripción a JoVE para ver este contenido. Inicie sesión o comience su prueba gratuita.
Transcript
Please note that all translations are automatically generated.
Begynn med å plassere et stykke benvoks i to cellekulturplater merket som test og kontroll. Pipette en passende mengde bioluminescens som uttrykker brystkreftceller ved hvert platesenter og inkuberer platene for en bestemt varighet for å hjelpe cellevedlegg. Legg et lite bein på beinvoksen i testplaten og fest den ved å påføre trykk.
Hell sakte et cellekulturmedium med føtal bovint serum, et veksttilskudd, til hver plateside for å nedsenke utløpet og inkubere ved 37 grader Celsius for en bestemt varighet. Benvevet i testplaten frigjør løselige faktorer, som cytokiner og SRC-kinase, som tiltrekker seg brystkreftceller, noe som resulterer i migrasjon. Legg et substrat til hver plate og legg platene på et bioluminescensavbildningskammer.
Kreftcellen som uttrykker bioluminescerende protein oksiderer substratet og avgir lys. Kvantifisere spredning ved å måle totale fotoner som slippes ut av hver celle ved hjelp av programvaren. Kreftceller i testplaten skal spre seg raskere enn cellene i kontrollplaten. I den følgende protokollen vil vi samkulturere brystkreftceller ved siden av lårbenet utviser for å måle brystcelleproliferasjon.
For dette eksperimentet, forberede en brystkreftcelle suspensjon med 100,000 celler per 50 mikroliter DMEM pluss 10% FBS. I tillegg forbereder plugger av beinvoks for å immobilisere beinfragmentene. Bruk de avskårne endene på en mikropipettespiss til å oppbevare pluggene i en petriskål. Deretter overfører du pluggene til en seksbrønnsplate med tang og bruker en steril hanske, og trykker pluggene inn i 12-tiden.
Deretter piper 50 mikroliter av cellefjæringen inn i midten av hver brønn. Plasser platen i en vevskulturinkubator i 45 minutter for å fremme cellefeste. Mens platen inkuberer, trekk ut beinfragmentene. Med cellene festet til platen, plasser beinvevsfragmentene på beinvoksen i 3 brønner, og trykk hver ned ved hjelp av rongeuren. Tre brønner uten fragment fungerer som kontroller.
Deretter legger du sakte til fem milliliter DMEM pluss 10% FBS til veggen til hver brønn. Beinvoksen og beinfragmentene må ikke løsnes. Inkuber deretter kulturen i 20 til 24 timer. Neste dag kan du se for deg cellene. Først tilsett 300 mikrogram per milliliter luciferin til hver brønn, og bilde deretter platen umiddelbart med en IVIS-bildeplattform.
