Co-culturing BC Cells: Culturing Breast Cancer Cells with Bone Fragments to Study Cancer Cell Proliferation

1. Co-Culturing Breast Cancer Cells Adjacent To Bone Fragments to Measure Breast Cell Proliferation Using BLI

1. Bereiten Sie vor dem Experiment eine Suspension mit 2 x 10⁵ Brustkrebszellen/50 l vor und bereiten Sie Knochenwachsstecker für die Immobilisierung von Knochenfragmenten in der Kultur vor. Schneiden Sie eine P200-Mikropipettespitze in 3 Stücke und verwenden Sie das schmale Ende des größten Stücks in einer "Cookie-Cutter"-Manier, um kleine (ca. 35 mg) Stück Knochenwachs zu schneiden. Verwenden Sie das breite Ende des kleinsten Stückes, um die Knochenwachsstopfen zur Lagerung in eine Petrischale zu werfen.
2. Legen Sie ein Stück Knochenwachs an die 12-Uhr-Position jedes Brunnens und drücken Sie vorsichtig mit einem steril-gloved Zeigefinger nach unten.
3. Pipette 50 l Zellsuspension mit 1 x 10⁵ Brustkrebszellen in DMEM-10% FBS + Pen-Strep in der Mitte jedes Brunnens einer 6-Well-Platte. (Alternativ können Samenzellen in einem dispergierten Muster, falls gewünscht,) Legen Sie die Platte 45 min in einen 37 °C-Gewebekultur-Inkubator, um die Zellanhaftung zu fördern.
4. Legen Sie 1 Knochenfragment auf 1 Stück Knochenwachs für jeden Experimentierbrunnen und wenden Sie sanften Druck mit dem Rongeur an, um ihn zu sichern. Führen Sie Experimente in Dreifacharbeit durch, so dass 3 Knochenfragmente aus einer bestimmten THR-Probe in die oberen drei Brunnen gelegt werden, während die unteren drei Brunnen Knochenwachs nur als Steuerung enthalten.
5. Mit einer 5 ml Pipette, sanft und langsam liefern 5 ml DMEM-10% FBS an der Seite jedes Brunnens, um zu vermeiden, die Brustzellen oder Knochenfragmente zu vertreiben. Legen Sie die Platte in einen 37 °C Gewebekultur-Inkubator für 20-24 Stunden.
6. Um Biolumineszenz-Bildgebung (BLI) durchzuführen, entfernen Sie die Platte aus dem Inkubator und fügen Sie jedem Brunnen Luziferinsubstrat (um eine Konzentration von 300 g/ml zu erreichen) hinzu. Stellen Sie die Platte sofort auf einer IVIS Imaging Platform unter Verwendung der folgenden Parameter auf: F-Stop von 1, kleine Binning, Belichtungszeit von 1 Sek., Stufe D. Messen Sie die Signalintensität jedes Brunnens sowie die durchschnittliche Ausstrahlung (Photonen/Zweite/Quadratzentimeter/Steradian).
7. Verwenden Sie Bildgebungssoftware, um Regionen von Interesse (ROI) zu definieren, um die durchschnittliche Ausstrahlung für alle Versuchs- und Kontrollbrunnen zu quantifizieren. Exportieren Sie durchschnittliche Strahlungswerte in ein Excel-Blatt, um Statistiken durchzuführen und Diagramme zu generieren.