Embriyonik Fare Beyin Dilimlerinde Göç Eden Nöronların ve Glial Progenitörlerin Hızlandırılmış Görüntülenmesi
Summary
Serebral korteksin gelişimi sırasında, nöronlar ve glial hücreler ventrikülü kaplayan ventriküler bölgeden kaynaklanır ve beyin yüzeyine doğru göç eder. Bu süreçte birçok gen yer alır. Bu protokol, göç eden nöronların ve glial progenitörlerin hızlandırılmış görüntüleme tekniğini tanıtır.
Abstract
Serebral korteksin gelişimi sırasında, nöronlar ve glial hücreler ventrikülü kaplayan ventriküler bölgeden kaynaklanır ve beyin yüzeyine doğru göç eder. Bu süreç, uygun beyin fonksiyonu için çok önemlidir ve düzensizliği doğumdan sonra nörogelişimsel ve psikiyatrik bozukluklara neden olabilir. Aslında, bu hastalıklardan sorumlu birçok genin bu süreçte yer aldığı bulunmuştur ve bu nedenle, bu mutasyonların hücresel dinamikleri nasıl etkilediğini ortaya koymak, bu hastalıkların patogenezini anlamak için önemlidir. Bu protokol, fare embriyolarından elde edilen beyin dilimlerinde göç eden nöronların ve glial progenitörlerin hızlandırılmış görüntülenmesi için bir teknik sunar. Hücreler, ventriküler bölgeden yüksek bir sinyal-gürültü oranıyla göç eden tek tek hücreleri görselleştiren utero elektroporasyon kullanılarak floresan proteinlerle etiketlenir. Ayrıca, bu in vivo gen transfer sistemi, ekspresyonlarının veya knockdown/knockout vektörlerinin birlikte elektroporasyonu yoluyla verilen genler üzerinde fonksiyon kazancı veya fonksiyon kaybı deneylerini kolayca gerçekleştirmemizi sağlar. Bu protokol kullanılarak, tek tek hücrelerin göç davranışı ve göç hızı, sabit beyinlerden asla elde edilemeyen bilgiler analiz edilebilir.
Introduction
Serebral korteksin gelişimi sırasında, lateral ventrikülü kaplayan pallial ventriküler bölgedeki (VZ) (apikal) radyal glia, önce nöronları ve daha sonra bazı örtüşen periyotlarlaglial progenitörleri üretir 1. Nöronlar ayrıca, her ikisi de (apikal) radyal glia 2,3’ten kaynaklanan, VZ’ye bitişik subventriküler bölgedeki (SVZ) ara progenitörlerden veya bazal radyal gliadan üretilir. Farelerde, radyal glial hücreler embriyonik gün (E) 12-14’te sadece nöronlar, E15-16’da hem nöronlar hem de glial progenitörler ve E17’den itibaren glial progenitörlerüretir 4. Bu embriyonik aşamalar sırasında üretilen ana glial progenitör popülasyonu tercihen astrositlere farklılaşır, ancak bazı hücreler de oligodendrositlerefarklılaşır 5. Bu aşamalarda üretilen nöronlar ve astrosit progenitörleri beyin yüzeyine doğru göç eder ve kortikal plakaya (gelecekteki kortikal gri madde) girer. VZ’den kortikal plakaya nöronal göç çoklu fazlarda gerçekleşir. Nöronlar ilk olarak, çok kutuplu hücre birikim bölgesinin (MAZ) hemen üzerinde, SVZ veya ara bölge ile örtüşen çok kutuplu bir morfoloji benimserler, burada çok sayıda ince süreci kuvvetli bir şekilde uzatıp geri çekerler ve yavaşça göç ederler (çok kutuplu göç)6,7. Yaklaşık 24 saat sonra, nöronlar bipolar bir morfolojiye dönüşür, beyin yüzeyine doğru kalın bir öncü süreci ve geriye doğru ince bir takip sürecini uzatır ve radyal gliadan pial yüzeye uzanan radyal bir süreç kullanarak doğrusal olarak beyin yüzeyine doğru göç eder, buna lokomosyon modu 2,8 denir. Hareket modundaki nöronlar her zaman kortikal plakanın en dış yüzeyine ulaştıklarından, marjinal bölgenin hemen altındaki öncüllerinden geçtiğinden, nöronlar kortikal plaka 9,10,11’de doğum tarihine bağlı içten dışa bir şekilde hizalanır.
Buna karşılık, astrosit ataları, sık yön değişiklikleri ile ara bölgeye ve kortikal plakaya hızla göç eder. Bu göç davranışı, nöronal göçten tamamen farklıdır ve düzensiz göçolarak adlandırılır 5. Astrosit ataları ayrıca kan damarı güdümlü göç adı verilen bir süreçte kan damarları boyunca göç eder. Astrosit progenitörleri bu göç modları arasında geçiş yapar ve kortikal plakayaulaşır 5,12. Astrositlerin konumları üretim tarihlerine göre kesin olarak belirlenmese de, erken doğan astrositlerin kortikal plakanın yüzeysel kısmına yerleşmesi için hafif bir eğilim gözlenmiştir5. İlginç bir şekilde, kortikal plakaya yerleşen astrositler embriyonik aşamalarda üretilir ve sonunda protoplazmik astrositlere farklılaşırken, doğum sonrası üretilen astrositler aktif olarak göç etmez, beyaz cevherde kalır ve fibröz astrositlere farklılaşır5. Astrositik alt tiplerin bu aşamaya bağlı spesifikasyonunun nasıl oluştuğu belirsizliğini korumaktadır.
Nörogelişimsel ve psikiyatrik bozukluklarda yer alanlar da dahil olmak üzere, nöronal göçte yer alan artan sayıda gen tanımlanmıştır13,14. Bu nedenle, bu genlerdeki mutasyonların göç eden nöronların davranışları üzerindeki etkilerini aydınlatmak çok önemlidir. Daha önce de belirtildiği gibi, nöronal göç birden fazla aşamada gerçekleşir. Hızlandırılmış gözlemler, esas olarak etkilenen fazı doğrudan belirleyebilir (hücre döngüsü çıkışı, çok kutuplu-bipolar geçiş, hareketin göç hızı, vb.). Bununla birlikte, astrositlerin spesifikasyonu, göçü ve konumlandırılmasının altında yatan moleküler mekanizmalar büyük ölçüde bilinmemektedir. Astrositlerin sinaptogenezde15 ve beyin gelişimi sırasında kan-beyin bariyeri oluşumunda çok önemli roller oynadığı göz önüne alındığında16, astrositlerdeki gelişimsel kusurlar nörogelişimsel bozukluklara neden olabilir. Astrosit progenitörleri üzerinde yapılan hızlandırılmış çalışmalar, bu moleküler mekanizmaları ve bunların akıl hastalığı ile ilişkisini açıklığa kavuşturabilir.
Bu protokol, kortikal VZ’den türetilmiş hücrelerin hızlandırılmış gözlemi için bir yöntem sağlar. Nöronal göçün gözlemlenmesi için benzer bir video protokolü zaten yayınlanmıştır17. Burada, hem göç eden nöronlar hem de astrosit progenitörleri için yöntemi açıklıyoruz. Bu hücreleri yeşil ve kırmızı floresan proteinleri (GFP ve RFP) gibi floresan proteinlerle etiketlemek için, uygun bileşenleri içeren plazmit karışımları, uygun aşamalarda utero elektroporasyon ile kortikal VZ’yeverilir 18,19,20,21. Manipüle edilen embriyolar istenen aşamalarda çıkarılır ve beyinler dilimlenir ve bir lazer tarama mikroskobu kullanılarak hızlandırılmış gözlemler için kullanılır. Sabit beyin örnekleri kullanılarak asla ele alınmayan göç hızı, yönü ve diğer davranışlar bu yöntem kullanılarak incelenebilir. In utero elektroporasyon kullanımı, ekspresyon ve knockdown/knockout vektörleri, floresan protein vektörleri ile eş zamanlı olarak kolayca aktarılabilir, bu da belirli genlerin fonksiyon kazancı ve fonksiyon kaybı çalışmalarını yürütmemizi sağlar.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu protokol, pallial (kortikal) VZ’den türetilen hücrelerin hızlandırılmış gözlemi için bir yöntem tanıttı. VZ’den göç eden hücreleri etiketlemek için, tek tek hücrelerin viral vektör aracılı etiketlemeden daha yüksek bir sinyal-gürültü oranıyla açıkça etiketlendiği utero elektroporasyonda kullandık. Utero elektroporasyon kullanılarak, herhangi bir kombinasyondaki herhangi bir vektör türü, canlı embriyolardaki radyal glial hücrelere (nöral kök hücreler) kolayca sok…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Tα1 destekçisi, P. Barker ve F.D. Miller’ın hediyesidir. Dcx organizatörü, Q. Lu’nun bir hediyesidir. hGFAP-Cre, Albee Messing’in bir hediyesiydi. PiggyBac transpozon vektör sistemi Sanger Enstitüsü tarafından sağlandı. Flt1-DsRed fareleri M. Ema (Shiga Üniversitesi) tarafından sağlandı. Bu çalışma JSPS KAKENHI (H. Tabata’ya JP21K07309 numaralı hibe JP20H05688 ve K. Nakajima’ya JP22K19365) ve Takeda Bilim Vakfı, Keio Gijuku Fukuzawa Eğitim ve Araştırmanın İlerlemesi Anma Fonu, K. Nakajima’ya Keio Gijuku Akademik Gelişim Fonları tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Aspirator tube assembly | Drummond | 2-040-000 | |
| Atipamezole (5 mg/mL) | Meiji | Mepatia | |
| Autoclip | Becton Dickinson | 427630 | 9 mm |
| B27 supplement | Gibco | 17504-044 | |
| Butorphanol (5 mg/mL) | Meiji | Vetorphale | |
| Cell culture insert | Millipore | PICM ORG 50 | |
| Confocal microscope | Nikon | A1RHD25 | Equipped with a long working distance lens (S Plan Fluor ELWD 20XC) |
| Cryomold | Tissue-Tek | 4566 | |
| Culture chamber | Tokken | TK-NBCMP | Custom-made |
| Electroporator | NEPA Gene | NEPA21 | |
| Fast Green | Sigma-Aldrich | F7258 | |
| Gas mixer | Tokken | TK-MIGM01-02 | |
| Glass base dish | Iwaki | 3910-035 | Diameter of glass base is 27 mm |
| Glass capillaries | Narishige | GD-1 | |
| HBS (2x) | Sigma-Aldrich | 51558 | |
| HBSS(-) | Wako | 084-08345 | |
| Heater Unit | Tokken | TK-0003HU20 | Custom-made, including hood and heater |
| hGFAP-Cre | Addgene | #40591 | A gift from Albee Messing |
| ImageJ | https://imagej.net/ij/ | ||
| L-glutamine (200 mM) | Gibco | 25030 | |
| Low melting temperature agarose | Lonza | 50100 | |
| Medetomidine (1 mg/mL) | Meiji | Medetomin | |
| Microinjector | Narishige | IM-300 | |
| Midazolam (5 mg/mL) | Sandoz | Midazolam | |
| MTrackJ | https://imagescience.org/meijering/software/mtrackj/ | ||
| Neurobasal medium | Gibco | 21103-049 | |
| pCAG-hyPBase | The hyPBase cDNA from pCMV-hyPBase (a gift from Sanger Institute) was inserted into the downstream of the CAG promoter of pCAGGS (a gift from J. Miyazaki). | ||
| pDcx-Dre | The Dcx promoter from Dcx4kbEGFP70 (a gift from Q. Lu) was exchanged with CAG promoter of pCAG-NLS-HA-Dre34 (a gift from Pawel Pelczar, Addgene #51272). | ||
| Penicillin + Streptomycin | Gibco | 15140122 | |
| Plasmid purification kit | Invitrogen | PureLink HiPure plasmid midiprep kit (K210005) | |
| pPB-CAG-LNL-RFP | CAG-LNL cassette from pCALNL-DsRed (a gift from Connie Cepko, Addgene #13769), and TurboRFP cDNA (Evrogen, FP232) were inserted into the cloning site of pPB-CAG.EBNXN (a gift from Sanger Institute). | ||
| pPB-CAG-rDIO-EGFP | The sequence containning synthetic rox sites, synthetic DIO cassette, and EGFP cDNA from pEGFP-N1 (Clontech, U55762) in reverse direction were inserted into the cloning site of pPB-CAG.EBNXN (a gift from Sanger Institute). The sequence is provided in the Supplementary File. | ||
| Puller | Narishige | PN-31 | |
| StackRed | a plugin for ImageJ | http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/stackreg/ | |
| Suture needle | Nazme | C-24-521-R No.1 | 1/2 circle, length 14 mm |
| Suture thread | Nazme | C-23-B2 | Silk, size 5-0 |
| Timed pregnant ICR (wild-type) mice | Japan SLC | ICR mouse | |
| TrackMate | https://imagej.net/plugins/trackmate/index | ||
| Tweezer-type electrode | BEX or NEPA Gene | CUY650P5 | |
| Tα1-EGFP | EGFP cDNA from pEGFP-N1 (Clontech, U55762) was inserted into the downstream of the Tα1 promoter in plasmid 253 (a gift from P. Barker and F.D.Miller) | ||
| Vibrating microtome | Leica or Zeiss | Vibrating blade microtome VT1000S or Hyrax V50. |
References
- Kriegstein, A., Alvarez-Buylla, A. The glial nature of embryonic and adult neural stem cells. Annu Rev Neurosci. 32 (1), 149-184 (2009).
- Noctor, S. C., Martínez-Cerdeño, V., Ivic, L., Kriegstein, A. R. Cortical neurons arise in symmetric and asymmetric division zones and migrate through specific phases. Nat Neurosci. 7 (2), 136-144 (2004).
- Haubensak, W., Attardo, A., Denk, W., Huttner, W. B. Neurons arise in the basal neuroepithelium of the early mammalian telencephalon: A major site of neurogenesis. P Natl Acad Sci USA. 101 (9), 3196-3201 (2004).
- Yoshida, A., Yamaguchi, Y., Nonomura, K., Kawakami, K., Takahashi, Y., Miura, M. Simultaneous expression of different transgenes in neurons and glia by combining in utero electroporation with the Tol2 transposon-mediated gene transfer system. Genes Cells. 15 (5), 501-512 (2010).
- Tabata, H., et al. Erratic and blood vessel-guided migration of astrocyte progenitors in the cerebral cortex. Nat Commun. 13 (1), 6571 (2022).
- Tabata, H., Nakajima, K. Multipolar Migration: The third mode of radial neuronal migration in the developing cerebral cortex. J Neurosci. 23 (31), 9996-10001 (2003).
- Tabata, H., Kanatani, S., Nakajima, K. Differences of migratory behavior between direct progeny of apical progenitors and basal progenitors in the developing cerebral cortex. Cereb Cortex. 19 (9), 2092-2105 (2009).
- Rakic, P. Mode of cell migration to the superficial layers of fetal monkey neocortex. J Comp Neurol. 145 (1), 61-83 (1972).
- Sekine, K., Honda, T., Kawauchi, T., Kubo, K., Nakajima, K. The outermost region of the developing cortical plate is crucial for both the switch of the radial migration mode and the Dab1-dependent "inside-out" lamination in the neocortex. J Neurosci. 31 (25), 9426-9439 (2011).
- Shin, M., et al. Both excitatory and inhibitory neurons transiently form clusters at the outermost region of the developing mammalian cerebral neocortex. J Comp Neurol. 527 (10), 1577-1597 (2019).
- Sekine, K., et al. Reelin controls neuronal positioning by promoting cell-matrix adhesion via inside-out activation of integrin α5β1. Neuron. 76 (2), 353-369 (2012).
- Morimoto, K., Tabata, H., Takahashi, R., Nakajima, K. Interactions between neural cells and blood vessels in central nervous system development. BioEssays. 230091, (2023).
- Tabata, H., Nagata, K. Decoding the molecular mechanisms of neuronal migration using in utero electroporation. Med Mol Morphol. 49 (2), 63-75 (2016).
- Ishii, K., Kubo, K., Nakajima, K. Reelin and neuropsychiatric disorders. Front Cell Neurosci. 10, 229 (2016).
- Bosworth, A. P., Allen, N. J. The diverse actions of astrocytes during synaptic development. Curr Opin Neurobiol. 47, 38-43 (2017).
- Tabata, H. Crosstalk between blood vessels and glia during the central nervous system development. Life. 12 (11), 1761 (2022).
- Wiegreffe, C., Feldmann, S., Gaessler, S., Britsch, S. Time-lapse confocal imaging of migrating neurons in organotypic slice culture of embryonic mouse brain using in utero electroporation. J Vis Exp. (125), e55886 (2017).
- Saito, T., Nakatsuji, N. Efficient Gene Transfer into the Embryonic Mouse Brain Using in Vivo Electroporation. Dev Biol. 240 (1), 237-246 (2001).
- Tabata, H., Nakajima, K. Labeling embryonic mouse central nervous system cells by in utero electroporation. Dev Growth Differ. 50 (6), 507-511 (2008).
- Tabata, H., Nakajima, K. Efficient in utero gene transfer system to the developing mouse brain using electroporation: visualization of neuronal migration in the developing cortex. Neuroscience. 103 (4), 865-872 (2001).
- Fukuchi-Shimogori, T. Neocortex patterning by the secreted signaling molecule FGF8. Science. 294 (5544), 1071-1074 (2001).
- Matsumoto, K., et al. Study of normal and pathological blood vessel morphogenesis in Flt1-tdsRed BAC Tg mice. Genesis. 50 (7), 561-571 (2012).
- Kawai, S., Takagi, Y., Kaneko, S., Kurosawa, T. Effect of three types of mixed anesthetic agents alternate to ketamine in mice. Exp Anim. 60 (5), 481-487 (2011).
- Meijering, E., Dzyubachyk, O., Smal, I. Methods for cell and particle tracking. Methods Enzymol. 504, 183-200 (2012).
- Ershov, D., et al. TrackMate 7: Integrating state-of-the-art segmentation algorithms into tracking pipelines. Nat Methods. 19 (7), 829-832 (2022).
- Tinevez, J. -. Y., et al. TrackMate: An open and extensible platform for single-particle tracking. Methods. 115, 80-90 (2017).
- Gloster, A., et al. The T alpha 1 alpha-tubulin promoter specifies gene expression as a function of neuronal growth and regeneration in transgenic mice. J Neurosci. 14 (12), 7319-7330 (1994).
- Zhuo, L., et al. hGFAP-cre transgenic mice for manipulation of glial and neuronal function in vivo. Genesis. 31 (2), 85-94 (2001).
- Yusa, K., Zhou, L., Li, M. A., Bradley, A., Craig, N. L. A hyperactive piggyBac transposase for mammalian applications. P Natl Acad Sci USA. 108 (4), 1531-1536 (2011).
- Chen, F., LoTurco, J. A method for stable transgenesis of radial glia lineage in rat neocortex by piggyBac mediated transposition. J Neurosci Meth. 207 (2), 172-180 (2012).
- Wang, X., Qiu, R., Tsark, W., Lu, Q. Rapid promoter analysis in developing mouse brain and genetic labeling of young neurons by doublecortin-DsRed-express. J Neurosci Res. 85 (16), 3567-3573 (2007).
- Sauer, B. DNA recombination with a heterospecific Cre homolog identified from comparison of the pac-c1 regions of P1-related phages. Nucleic Acids Res. 32 (20), 6086-6095 (2004).
- Hermann, M., et al. Binary recombinase systems for high-resolution conditional mutagenesis. Nucleic Acids Res. 42 (6), 3894-3907 (2014).
- Kanatani, S., et al. The COUP-TFII/Neuropilin-2 is a molecular switch steering diencephalon-derived GABAergic neurons in the developing mouse brain. P Natl Acad Sci USA. 112 (36), E4985-E4994 (2015).
- Yozu, M., Tabata, H., Nakajima, K. The caudal migratory stream: A novel migratory stream of interneurons derived from the caudal ganglionic eminence in the developing mouse forebrain. J Neurosci. 25 (31), 7268-7277 (2005).
- Kanatani, S., Yozu, M., Tabata, H., Nakajima, K. COUP-TFII is preferentially expressed in the caudal ganglionic eminence and is involved in the caudal migratory stream. J Neurosci. 28 (50), 13582-13591 (2008).
- Kitazawa, A., et al. Hippocampal pyramidal neurons switch from a multipolar migration mode to a novel "climbing" migration mode during development. J Neurosci. 34 (4), 1115-1126 (2014).
