Imagerie en accéléré de neurones migrateurs et de progéniteurs gliaux dans des tranches de cerveau de souris embryonnaires

Au cours du développement du cortex cérébral, la glie radiale (apicale) dans la zone ventriculaire palléenne (VZ) tapissant le ventricule latéral produit d’abord des neurones, puis des progéniteurs gliaux avec une période¹ qui se chevauche. Les neurones sont également générés à partir de progéniteurs intermédiaires ou de la glie radiale basale dans la zone sous-ventriculaire (SVZ) adjacente à la VZ, qui proviennent toutes deux de la glie radiale (apicale) ^2,3. Chez la souris, les cellules gliales radiales ne produisent que des neurones le jour embryonnaire (E) 12-14, des neurones et des progéniteurs gliaux le jour E15-16, et des progéniteurs gliaux à partir de E17⁴. La principale population de progéniteurs gliaux générée au cours de ces stades embryonnaires se différencie préférentiellement en astrocytes, bien que certaines cellules se différencient également en oligodendrocytes⁵. Les neurones et les progéniteurs astrocytaires générés à ces stades migrent vers la surface du cerveau et pénètrent dans la plaque corticale (future matière grise corticale). La migration neuronale de la VZ à la plaque corticale se produit en plusieurs phases. Les neurones adoptent d’abord une morphologie multipolaire juste au-dessus de la zone d’accumulation de cellules multipolaires (MAZ), chevauchant la SVZ ou zone intermédiaire, où ils étendent et rétractent vigoureusement plusieurs processus minces et migrent lentement (migration multipolaire)^6,7. Après environ 24 heures, les neurones se transforment en une morphologie bipolaire, étendant un processus de pointe épais vers la surface du cerveau et un processus de traînée mince vers l’arrière, et migrent linéairement vers la surface du cerveau en utilisant un processus radial s’étendant de la glie radiale à la surface piale comme un échafaudage, appelé mode de locomotion ^2,8. Parce que les neurones en mode de locomotion atteignent toujours la surface la plus externe de la plaque corticale, en passant par leurs prédécesseurs juste en dessous de la zone marginale, les neurones sont alignés de l’intérieur vers l’extérieur en fonction de la date de naissance dans la plaque corticale ^9,10,11.

En revanche, les progéniteurs des astrocytes migrent rapidement vers la zone intermédiaire et la plaque corticale, avec des changements de direction fréquents. Ce comportement migratoire est complètement différent de la migration neuronale et est appelé migration erratique⁵. Les progéniteurs des astrocytes migrent également le long des vaisseaux sanguins dans un processus appelé migration guidée par les vaisseaux sanguins. Les progéniteurs des astrocytes passent d’un mode de migration à l’autre et atteignent la plaque corticale ^5,12. Bien que le positionnement des astrocytes ne soit pas strictement déterminé par leur date de production, une légère tendance des astrocytes précoces à s’installer dans la partie superficielle de la plaque corticale a été observée⁵. Il est intéressant de noter que les astrocytes qui s’installent dans la plaque corticale sont générés à des stades embryonnaires et finissent par se différencier en astrocytes protoplasmiques, tandis que les astrocytes générés après la naissance ne migrent pas activement, restent dans la substance blanche et se différencient en astrocytes fibreux⁵. La façon dont cette spécification des sous-types astrocytaires dépend du stade se produit reste incertaine.

Un nombre croissant de gènes impliqués dans la migration neuronale ont été identifiés, y compris ceux impliqués dans les troubles neurodéveloppementaux et psychiatriques^13,14. Par conséquent, il est crucial d’élucider les effets des mutations de ces gènes sur le comportement des neurones en migration. Comme mentionné précédemment, la migration neuronale se produit en plusieurs phases. Les observations en accéléré permettent de déterminer directement la phase qui est principalement affectée (sortie du cycle cellulaire, transition multipolaire-bipolaire, vitesse de migration de la locomotion, etc.). Cependant, les mécanismes moléculaires sous-jacents à la spécification, à la migration et au positionnement des astrocytes restent largement inconnus. Étant donné que les astrocytes jouent un rôle crucial dans la synaptogenèse¹⁵ et la formation de la barrière hémato-encéphalique au cours du développement cérébral¹⁶, les anomalies du développement des astrocytes peuvent entraîner des troubles neurodéveloppementaux. Des études en accéléré sur les progéniteurs des astrocytes pourraient clarifier ces mécanismes moléculaires et leur relation avec la maladie mentale.

Ce protocole fournit une méthode d’observation en accéléré des cellules corticales dérivées de VZ. Un protocole vidéo similaire pour l’observation de la migration neuronale a déjà été publié¹⁷. Ici, nous décrivons la méthode pour migrer les neurones et les progéniteurs des astrocytes. Pour marquer ces cellules avec des protéines fluorescentes, telles que des protéines fluorescentes vertes et rouges (GFP et RFP), des mélanges de plasmides contenant des composants appropriés sont introduits dans la VZ corticale par électroporation in utero aux stades appropriés 18,19,20,21. Les embryons manipulés sont retirés aux stades souhaités, et les cerveaux sont découpés et utilisés pour des observations en accéléré à l’aide d’un microscope à balayage laser. La vitesse de migration, la direction et d’autres comportements, qui ne sont jamais abordés à l’aide d’échantillons de cerveau fixes, peuvent être examinés à l’aide de cette méthode. En utilisant l’électroporation in utero, l’expression et les vecteurs knockdown/knock-out peuvent être facilement transférés en concomitance avec des vecteurs protéiques fluorescents, ce qui nous permet de mener des études de gain et de perte de fonction de gènes spécifiques.