Zeitraffer-Bildgebung von migrierenden Neuronen und glialen Vorläuferzellen in embryonalen Hirnschnitten von Mäusen

Während der Entwicklung der Großhirnrinde produzieren die (apikalen) radialen Gliazellen in der pallidialen ventrikulären Zone (VZ), die den lateralen Ventrikel auskleiden, zuerst Neuronen und dann gliale Vorläuferzellen mit einer gewissen Überlappung der Periode¹. Neuronen werden auch aus intermediären Vorläuferzellen oder basalen radialen Gliazellen in der an die VZ angrenzenden subventrikulären Zone (SVZ) erzeugt, die beide aus den (apikalen) radialen Gliazellen stammen ^2,3. Bei Mäusen produzieren radiale Gliazellen nur Neuronen am Embryonaltag (E) 12-14, sowohl Neuronen als auch gliale Vorläuferzellen an E15-16 und gliale Vorläuferzellen ab E17⁴. Die Hauptpopulation von Gliavorläuferzellen, die in diesen embryonalen Stadien erzeugt werden, differenziert sich bevorzugt in Astrozyten, obwohl sich einige Zellen auch in Oligodendrozyten differenzieren⁵. Neuronen und Astrozyten-Vorläuferzellen, die in diesen Stadien gebildet werden, wandern zur Gehirnoberfläche und gelangen in die kortikale Platte (zukünftige kortikale graue Substanz). Die neuronale Migration von der VZ zur kortikalen Platte erfolgt in mehreren Phasen. Neuronen nehmen zunächst eine multipolare Morphologie knapp über der multipolaren Zellakkumulationszone (MAZ) an, die die SVZ oder Zwischenzone überlappt, wo sie mehrere dünne Prozesse kräftig aus- und zurückziehen und langsam wandern (multipolare Migration)^6,7. Nach etwa 24 Stunden verwandeln sich die Neuronen in eine bipolare Morphologie, die einen dicken Führungsfortsatz zur Gehirnoberfläche und einen dünnen Nachlauffortsatz nach hinten verlängert und linear zur Hirnoberfläche wandert, wobei ein radialer Prozess verwendet wird, der sich von der radialen Gliazelle bis zur Pialoberfläche als Gerüst erstreckt und als Lokomotionsmodus^{bezeichnet wird 2,8}. Da Neuronen im Fortbewegungsmodus immer die äußerste Oberfläche der kortikalen Platte erreichen und ihre Vorgänger knapp unterhalb der Marginalzone durchlaufen, sind die Neuronen in der kortikalen Platte ^9,10,11 geburtsdatumsabhängig von innen nach außen ausgerichtet.

Im Gegensatz dazu wandern Astrozyten-Vorläuferzellen schnell in die Zwischenzone und die kortikale Platte, mit häufigen Richtungswechseln. Dieses Migrationsverhalten unterscheidet sich grundlegend von der neuronalen Migration und wird als unregelmäßige Migration^{bezeichnet 5}. Astrozyten-Vorläuferzellen wandern auch entlang der Blutgefäße, in einem Prozess, der als blutgefäßgesteuerte Migration bezeichnet wird. Astrozyten-Vorläuferzellen wechseln zwischen diesen Migrationsmodi und erreichen die kortikale Platte ^5,12. Obwohl die Positionierung von Astrozyten nicht streng durch ihr Entstehungsdatum bestimmt ist, wurde eine leichte Tendenz bei frühgeborenen Astrozyten beobachtet, sich im oberflächlichen Teil der kortikalen Platte^{anzusiedeln 5}. Interessanterweise werden Astrozyten, die sich in der kortikalen Platte ansiedeln, in embryonalen Stadien erzeugt und differenzieren sich schließlich zu protoplasmatischen Astrozyten, während postnatal erzeugte Astrozyten nicht aktiv wandern, in der weißen Substanz verbleiben und sich in fibröse Astrozyten differenzieren⁵. Wie diese stadienabhängige Spezifizierung astrozytärer Subtypen zustande kommt, bleibt unklar.

Eine wachsende Anzahl von Genen, die an der neuronalen Migration beteiligt sind, wurde identifiziert, einschließlich solcher, die an neurologischen Entwicklungsstörungen und psychiatrischen Störungen beteiligt sind^13,14. Daher ist es wichtig, die Auswirkungen von Mutationen in diesen Genen auf das Verhalten migrierender Neuronen aufzuklären. Wie bereits erwähnt, verläuft die neuronale Migration in mehreren Phasen. Zeitrafferbeobachtungen können direkt bestimmen, welche Phase hauptsächlich betroffen ist (Zellzyklusaustritt, multipolar-bipolarer Übergang, Migrationsgeschwindigkeit der Fortbewegung, etc.). Die molekularen Mechanismen, die der Spezifizierung, Migration und Positionierung von Astrozyten zugrunde liegen, sind jedoch weitgehend unbekannt. Angesichts der Tatsache, dass Astrozyten eine entscheidende Rolle bei der Synaptogenese¹⁵ und der Bildung der Blut-Hirn-Schranke während der Gehirnentwicklung spielen¹⁶, können Entwicklungsdefekte in Astrozyten zu neurologischen Entwicklungsstörungen führen. Zeitrafferstudien an Astrozyten-Vorläuferzellen können diese molekularen Mechanismen und ihre Beziehung zu psychischen Erkrankungen klären.

Dieses Protokoll bietet eine Methode zur Zeitrafferbeobachtung von kortikalen VZ-abgeleiteten Zellen. Ein ähnliches Videoprotokoll zur Beobachtung der neuronalen Migration wurde bereits veröffentlicht¹⁷. Hier beschreiben wir die Methode sowohl für die Migration von Neuronen als auch für Astrozyten-Vorläuferzellen. Um diese Zellen mit fluoreszierenden Proteinen, wie z. B. grün und rot fluoreszierenden Proteinen (GFP und RFP), zu markieren, werden Plasmidgemische, die geeignete Komponenten enthalten, durch In-utero-Elektroporation in den entsprechenden Stadien 18,19,20,21 in die kortikale VZ eingebracht. Die manipulierten Embryonen werden in den gewünschten Stadien entnommen, die Gehirne werden in Scheiben geschnitten und für Zeitrafferbeobachtungen mit einem Laser-Scanning-Mikroskop verwendet. Die Migrationsgeschwindigkeit, -richtung und andere Verhaltensweisen, die niemals mit festen Gehirnproben behandelt werden, können mit dieser Methode untersucht werden. Durch die Verwendung von In-utero-Elektroporation können Expressions- und Knockdown-/Knockout-Vektoren leicht gleichzeitig mit fluoreszierenden Proteinvektoren übertragen werden, was es uns ermöglicht, Funktionsgewinn- und Funktionsverluststudien spezifischer Gene durchzuführen.