Покадровая визуализация мигрирующих нейронов и глиальных предшественников в эмбриональных срезах мозга мышей

Во время развития коры головного мозга (апикальная) радиальная глия в паллиальной желудочковой зоне (ВЗ), выстилающей латеральный желудочек, продуцирует сначала нейроны, а затем глиальные предшественники с некоторым перекрывающимся периодом¹. Нейроны также генерируются промежуточными предшественниками или базальной радиальной глией в субвентрикулярной зоне (SVZ), прилегающей к VZ, оба из которых происходят из (апикальной) радиальной глии ^2,3. У мышей радиальные глиальные клетки продуцируют только нейроны на эмбриональный день (E) 12-14, оба нейрона и глиальные предшественники на E15-16, а глиальные предшественники с E17 и^{далее 4}. Основная популяция глиальных предшественников, образованных на этих эмбриональных стадиях, преимущественно дифференцируется в астроциты, хотя некоторые клетки также дифференцируются в олигодендроциты5^. Нейроны и предшественники астроцитов, образующиеся на этих стадиях, мигрируют к поверхности мозга и попадают в корковую пластину (будущее корковое серое вещество). Миграция нейронов из VZ в корковую пластинку происходит в несколько фаз. Нейроны сначала принимают многополярную морфологию непосредственно над многополярной зоной накопления клеток (МАЗ), перекрывая SVZ или промежуточную зону, где они энергично расширяются и втягивают множественные тонкие отростки и медленно мигрируют (мультиполярная миграция)^6,7. Примерно через 24 ч нейроны трансформируются в биполярную морфологию, расширяя толстый ведущий отросток к поверхности мозга и тонкий отстающий отросток назад, и линейно мигрируют к поверхности мозга, используя радиальный отросток, простирающийся от радиальной глии к поверхности пиала в качестве каркаса, который называется режимом локомоции ^2,8. Поскольку нейроны в режиме локомоции всегда достигают самой внешней поверхности корковой пластинки, проходя через своих предшественников прямо под маргинальной зоной, нейроны выстраиваются в корковой пластинке ^9,10,11 в зависимости от даты рождения наизнанку.

Напротив, предшественники астроцитов быстро мигрируют в промежуточную зону и кортикальную пластинку, с частыми изменениями направления. Это миграционное поведение полностью отличается от миграции нейронов и называется эрратической миграцией^. Предшественники астроцитов также мигрируют по кровеносным сосудам в процессе, называемом миграцией, управляемой кровеносными сосудами. Предшественники астроцитов переключаются между этими режимами миграции и достигают корковой пластинки ^5,12. Несмотря на то, что расположение астроцитов строго не определяется датой их образования^{, наблюдалась} умеренная тенденция раннерожденных астроцитов оседать в поверхностной части корковой пластинки. Интересно, что астроциты, которые оседают в корковой пластинке, генерируются на эмбриональных стадиях и в конечном итоге дифференцируются в протоплазматические астроциты, в то время как постнатально генерируемые астроциты не мигрируют активно, остаются в белом веществе и дифференцируются в волокнистые астроциты^. Как происходит эта стадийно-зависимая спецификация астроцитарных подтипов, остается неясным.

Выявлено растущее число генов, участвующих в миграции нейронов, в том числе тех, которые участвуют в развитии нервной системы и психических расстройствах^13,14. Поэтому крайне важно выяснить влияние мутаций в этих генах на поведение мигрирующих нейронов. Как упоминалось ранее, миграция нейронов происходит в несколько фаз. Покадровые наблюдения могут непосредственно определить фазу, которая в основном затронута (выход из клеточного цикла, мультиполярно-биполярный переход, скорость миграции локомоции и т. д.). Тем не менее, молекулярные механизмы, лежащие в основе спецификации, миграции и позиционирования астроцитов, остаются в значительной степени неизвестными. Учитывая, что астроциты играют решающую роль в синаптогенезе15 и формировании гематоэнцефалического барьера во время развития ^мозга16, дефекты развития астроцитов могут приводить к нарушениям развития нервной системы. Покадровые исследования предшественников астроцитов могут прояснить эти молекулярные механизмы и их связь с психическими заболеваниями.

Этот протокол предоставляет метод покадрового наблюдения за корковыми клетками, полученными из VZ. Подобный видеопротокол для наблюдения за миграцией нейронов уже опубликован¹⁷. В этой статье мы опишем метод как для мигрирующих нейронов, так и для предшественников астроцитов. Для мечения этих клеток флуоресцентными белками, такими как зеленые и красные флуоресцентные белки (GFP и RFP), плазмидные смеси, содержащие соответствующие компоненты, вводят в кортикальную VZ путем внутриутробной электропорации на соответствующих стадиях 18,19,20,21. Манипулируемые эмбрионы удаляются на желаемых стадиях, а мозг разрезается и используется для покадровых наблюдений с помощью лазерного сканирующего микроскопа. Скорость, направление миграции и другие факторы поведения, которые никогда не рассматриваются с помощью фиксированных образцов мозга, могут быть изучены с помощью этого метода. Использование внутриутробной электропорации, экспрессии и нокдауна/нокаута векторов может быть легко перенесено одновременно с флуоресцентными белковыми векторами, что позволяет нам проводить исследования усиления и потери функции конкретных генов.