Time-lapse beeldvorming van migrerende neuronen en glia-voorlopercellen in embryonale hersenplakjes van muizen

Tijdens de ontwikkeling van de hersenschors produceren (apicale) radiale glia in de palliale ventriculaire zone (VZ) die de laterale ventrikel bekleedt, eerst neuronen en vervolgens gliale voorlopercellen met enige overlappende periode¹. Neuronen worden ook gegenereerd uit intermediaire voorlopercellen of basale radiale glia in de subventriculaire zone (SVZ) grenzend aan de VZ, die beide afkomstig zijn van de (apicale) radiale glia ^2,3. Bij muizen produceren radiale gliacellen alleen neuronen op embryonale dag (E) 12-14, zowel neuronen als glia-voorlopercellen op E15-16 en glia-voorlopercellen vanaf E17^4. De belangrijkste populatie glia-voorlopercellen die tijdens deze embryonale stadia worden gegenereerd, differentieert bij voorkeur tot astrocyten, hoewel sommige cellen ook differentiëren tot oligodendrocyten⁵. Neuronen en voorlopercellen van astrocyten die in deze stadia worden gegenereerd, migreren naar het hersenoppervlak en komen de corticale plaat binnen (toekomstige corticale grijze stof). Neuronale migratie van de VZ naar de corticale plaat vindt plaats in meerdere fasen. Neuronen nemen eerst een multipolaire morfologie aan net boven de multipolaire celaccumulatiezone (MAZ), overlappend met de SVZ of tussenliggende zone, waar ze meerdere dunne processen krachtig uitbreiden en intrekken en langzaam migreren (multipolaire migratie)^6,7. Na ongeveer 24 uur transformeren neuronen in een bipolaire morfologie, waarbij een dik leidend proces zich uitbreidt naar het hersenoppervlak en een dun achterblijvend proces naar achteren, en lineair naar het hersenoppervlak migreren met behulp van een radiaal proces dat zich uitstrekt van de radiale glia naar het piale oppervlak als een steiger, die voortbewegingsmodus ^2,8 wordt genoemd. Omdat neuronen in de voortbewegingsmodus altijd het buitenste oppervlak van de corticale plaat bereiken en door hun voorgangers net onder de marginale zone gaan, worden neuronen op een geboortedatum-afhankelijke inside-out manier uitgelijnd in de corticale plaat ^9,10,11.

Daarentegen migreren voorlopercellen van astrocyten snel naar de tussenliggende zone en de corticale plaat, met frequente richtingsveranderingen. Dit migratiegedrag is totaal anders dan neuronale migratie en wordt grillige migratie genoemd⁵. Voorlopers van astrocyten migreren ook langs bloedvaten in een proces dat bloedvatgeleide migratie wordt genoemd. Voorlopers van astrocyten schakelen tussen deze migratiemodi en bereiken de corticale plaat ^5,12. Hoewel de positionering van astrocyten niet strikt wordt bepaald door hun productiedatum, is er een milde neiging waargenomen bij vroeggeboren astrocyten om zich te nestelen in het oppervlakkige deel van de corticale plaat⁵. Interessant is dat astrocyten die zich in de corticale plaat nestelen, in embryonale stadia worden gegenereerd en uiteindelijk differentiëren tot protoplasmatische astrocyten, terwijl postnataal gegenereerde astrocyten niet actief migreren, in de witte stof blijven en differentiëren tot vezelachtige^astrocyten. Hoe deze fase-afhankelijke specificatie van astrocytische subtypes optreedt, blijft onduidelijk.

Er is een groeiend aantal genen geïdentificeerd die betrokken zijn bij neuronale migratie, waaronder genen die betrokken zijn bij neurologische ontwikkelingsstoornissen en psychiatrische stoornissen^13,14. Daarom is het cruciaal om de effecten van mutaties in deze genen op het gedrag van migrerende neuronen op te helderen. Zoals eerder vermeld, vindt neuronale migratie plaats in meerdere fasen. Time-lapse-waarnemingen kunnen direct de fase bepalen die het meest wordt beïnvloed (uitgang van de celcyclus, multipolaire-bipolaire overgang, migratiesnelheid van voortbeweging, enz.). De moleculaire mechanismen die ten grondslag liggen aan de specificatie, migratie en positionering van astrocyten blijven echter grotendeels onbekend. Aangezien astrocyten een cruciale rol spelen bij synaptogenese¹⁵ en de vorming van bloed-hersenbarrières tijdens de ontwikkeling van de hersenen¹⁶, kunnen ontwikkelingsstoornissen bij astrocyten leiden tot neurologische ontwikkelingsstoornissen. Time-lapse-studies naar voorlopercellen van astrocyten kunnen deze moleculaire mechanismen en hun relatie met psychische aandoeningen verduidelijken.

Dit protocol biedt een methode voor time-lapse-observatie van corticale VZ-afgeleide cellen. Een soortgelijk videoprotocol voor de observatie van neuronale migratie is al gepubliceerd¹⁷. Hier beschrijven we de methode voor zowel migrerende neuronen als astrocytenvoorlopercellen. Om deze cellen te labelen met fluorescerende eiwitten, zoals groene en rode fluorescerende eiwitten (GFP en RFP), worden plasmidemengsels met de juiste componenten in de corticale VZ geïntroduceerd door in utero elektroporatie in de juiste stadia 18,19,20,21. De gemanipuleerde embryo’s worden in de gewenste stadia verwijderd en de hersenen worden in plakjes gesneden en gebruikt voor time-lapse-observaties met behulp van een laserscanmicroscoop. De migratiesnelheid, richting en ander gedrag, dat nooit wordt aangepakt met behulp van vaste hersenmonsters, kan met deze methode worden onderzocht. Door gebruik te maken van in utero elektroporatie, expressie en knockdown/knock-out vectoren kunnen ze gemakkelijk gelijktijdig worden overgedragen met fluorescerende eiwitvectoren, waardoor we gain-of-function-en verlies-of-function-studies van specifieke genen kunnen uitvoeren.