大脳皮質の発達中、ニューロンとグリア細胞は、心室の内側を覆う心室ゾーンで発生し、脳表面に向かって移動します。このプロセスには多くの遺伝子が関与しています。このプロトコルでは、移動するニューロンとグリア前駆細胞のタイムラプスイメージングの技術を紹介します。
大脳皮質の発達中、ニューロンとグリア細胞は、心室の内側を覆う心室ゾーンで発生し、脳表面に向かって移動します。このプロセスは適切な脳機能にとって重要であり、その調節不全は出生後の神経発達障害や精神障害を引き起こす可能性があります。実際、これらの疾患の原因となる多くの遺伝子がこのプロセスに関与していることがわかっているため、これらの突然変異が細胞動態にどのように影響するかを明らかにすることは、これらの疾患の病因を理解するために重要です。このプロトコルは、マウス胚から得られた脳スライス中の移動するニューロンおよびグリア前駆細胞のタイムラプスイメージング技術を導入します。細胞は、 子宮内 エレクトロポレーションを使用して蛍光タンパク質で標識され、心室ゾーンから移動する個々の細胞を高いS/N比で視覚化します。また、この in vivo 遺伝子導入システムにより、遺伝子の発現やノックダウン/ノックアウトベクターの共エレクトロポレーションにより、遺伝子の機能獲得実験や機能喪失実験を容易に行うことができます。このプロトコルを用いることで、個々の細胞の移動行動や移動速度、つまり固定脳からは決して得られない情報を解析することができます。
大脳皮質の発達中、側脳室の内側を覆う蒼白心室ゾーン(VZ)の(頂端)橈骨グリアは、最初にニューロンを生成し、次にいくつかの重複する期間1を伴ってグリア前駆細胞を生成します。ニューロンは、VZに隣接する脳室内ゾーン(SVZ)の中間前駆細胞または基底橈骨グリアからも生成され、どちらも(頂端)橈骨グリア2,3に由来します。マウスでは、放射状グリア細胞は胚日(E)12-14にニューロンのみを産生し、E15-16ではニューロンとグリア前駆細胞を、E17以降はグリア前駆細胞を産生します4。これらの胚期に生成されたグリア前駆細胞の主要な集団は、優先的にアストロサイトに分化しますが、一部の細胞はオリゴデンドロサイトにも分化します5。これらの段階で生成されたニューロンとアストロサイト前駆細胞は、脳表面に向かって移動し、皮質プレート(将来の皮質灰白質)に入ります。VZから皮質板へのニューロンの移動は、複数の段階で発生します。ニューロンは、最初に多極細胞蓄積ゾーン(MAZ)のすぐ上で多極形態を採用し、SVZまたは中間ゾーンと重なり、そこで複数の薄いプロセスを激しく伸縮させ、ゆっくりと移動します(多極移動)6,7。約24時間後、ニューロンは双極性形態に変化し、脳表面に向かって厚い先行突起を伸ばし、後方に細い後続突起を伸ばし、放射状グリアから小孔表面まで足場として伸びる動径突起を用いて脳表面に向かって直線的に移動する。これをロコモーションモードと呼ぶ2,8.移動モードのニューロンは常に皮質板の最も外側の表面に到達し、その前身である辺縁帯のすぐ下を通過するため、ニューロンは皮質板9,10,11において生年月日に応じた裏返しに整列する。
対照的に、アストロサイト前駆細胞は、頻繁に方向を変えながら、中間ゾーンと皮質プレートに急速に移動します。この移動行動は、ニューロンの移動とは全く異なり、不規則な移動5と呼ばれる。アストロサイト前駆細胞は、血管誘導移動と呼ばれるプロセスで血管に沿って移動します。アストロサイト前駆細胞は、これらの移動モードを切り替えて皮質プレート5,12に到達します。アストロサイトの位置は、その産生年代によって厳密に決定されるわけではないが、早期に生まれたアストロサイトが皮質プレートの表層部に定着する穏やかな傾向が観察されている5。興味深いことに、皮質プレートに定着したアストロサイトは胚期に生成され、最終的には原形質アストロサイトに分化しますが、出生後に生成されたアストロサイトは活発に移動せず、白質に留まり、線維性アストロサイトに分化します5。このアストロサイトサブタイプのステージ依存的な仕様がどのように発生するかは、まだ不明です。
神経細胞の移動に関与する遺伝子の数が増えており、その中には神経発達障害や精神障害に関与する遺伝子も含まれています13,14。したがって、これらの遺伝子の突然変異が移動するニューロンの振る舞いに及ぼす影響を解明することが重要です。前述のように、ニューロンの移動は複数のフェーズで発生します。タイムラプス観察は、主に影響を受けるフェーズ(細胞周期の終了、多極性-双極転移、移動速度など)を直接決定できます。しかし、アストロサイトの仕様、移動、および配置の根底にある分子メカニズムは、ほとんどわかっていません。アストロサイトがシナプス形成15や脳の発達における血液脳関門形成16に重要な役割を果たしていることを考えると、アストロサイトの発達障害は神経発達障害を引き起こす可能性がある。アストロサイト前駆細胞のタイムラプス研究により、これらの分子メカニズムや精神疾患との関係が明らかになるかもしれません。
このプロトコルは、皮質VZ由来細胞のタイムラプス観察の方法を提供します。ニューロンの移動を観察するための同様のビデオプロトコルはすでに公開されています17。ここでは、移動するニューロンとアストロサイト前駆細胞の両方の方法について説明します。これらの細胞を、緑色および赤色の蛍光タンパク質(GFPおよびRFP)などの蛍光タンパク質で標識するために、適切な成分を含むプラスミド混合物を、適切な段階での子宮内エレクトロポレーションにより皮質VZに導入される18,19,20,21。操作した胚を所望の段階で取り出し、脳をスライスしてレーザー走査型顕微鏡によるタイムラプス観察に用います。移動速度、方向、およびその他の行動は、固定された脳サンプルを使用して対処されることは決してありませんが、この方法を使用して調べることができます。子宮内エレクトロポレーション、発現、ノックダウン/ノックアウトベクターは、蛍光タンパク質ベクターと併用して容易に導入できるため、特定の遺伝子の機能獲得および機能喪失の研究を行うことができます。
このプロトコルは、蒼白(皮質)VZに由来する細胞のタイムラプス観察の方法を導入しました。VZから移動する細胞を標識するために、子宮内エレクトロポレーションを使用し、個々の細胞をウイルスベクター媒介標識よりも高いS/N比で明確に標識しました。子宮内エレクトロポレーションを使用すると、任意の組み合わせの任意のタイプのベクターを、生きた胚の放射状グリア細?…
The authors have nothing to disclose.
Tα1プロモーターは、P.バーカーとFDミラーからの贈り物です。Dcxのプロモーターは、Q.ルーからの贈り物です。hGFAP-Cre は Albee Messing 氏からの贈り物でした。PiggyBacトランスポゾンベクターシステムは、Sanger Instituteから提供されました。Flt1-DsRedマウスは、滋賀大学(M. Ema)から提供されました。本研究は、日本学術振興会科学研究費助成(課題番号JP21K07309:田畑秀樹、JP20H05688・JP22K19365:中島和彦)、武田科学振興財団、慶應義塾教育研究振興基金、慶應義塾学術振興基金(中島和彦)の支援を受けて行われました。
Aspirator tube assembly | Drummond | 2-040-000 | |
Atipamezole (5 mg/mL) | Meiji | Mepatia | |
Autoclip | Becton Dickinson | 427630 | 9 mm |
B27 supplement | Gibco | 17504-044 | |
Butorphanol (5 mg/mL) | Meiji | Vetorphale | |
Cell culture insert | Millipore | PICM ORG 50 | |
Confocal microscope | Nikon | A1RHD25 | Equipped with a long working distance lens (S Plan Fluor ELWD 20XC) |
Cryomold | Tissue-Tek | 4566 | |
Culture chamber | Tokken | TK-NBCMP | Custom-made |
Electroporator | NEPA Gene | NEPA21 | |
Fast Green | Sigma-Aldrich | F7258 | |
Gas mixer | Tokken | TK-MIGM01-02 | |
Glass base dish | Iwaki | 3910-035 | Diameter of glass base is 27 mm |
Glass capillaries | Narishige | GD-1 | |
HBS (2x) | Sigma-Aldrich | 51558 | |
HBSS(-) | Wako | 084-08345 | |
Heater Unit | Tokken | TK-0003HU20 | Custom-made, including hood and heater |
hGFAP-Cre | Addgene | #40591 | A gift from Albee Messing |
ImageJ | https://imagej.net/ij/ | ||
L-glutamine (200 mM) | Gibco | 25030 | |
Low melting temperature agarose | Lonza | 50100 | |
Medetomidine (1 mg/mL) | Meiji | Medetomin | |
Microinjector | Narishige | IM-300 | |
Midazolam (5 mg/mL) | Sandoz | Midazolam | |
MTrackJ | https://imagescience.org/meijering/software/mtrackj/ | ||
Neurobasal medium | Gibco | 21103-049 | |
pCAG-hyPBase | The hyPBase cDNA from pCMV-hyPBase (a gift from Sanger Institute) was inserted into the downstream of the CAG promoter of pCAGGS (a gift from J. Miyazaki). | ||
pDcx-Dre | The Dcx promoter from Dcx4kbEGFP70 (a gift from Q. Lu) was exchanged with CAG promoter of pCAG-NLS-HA-Dre34 (a gift from Pawel Pelczar, Addgene #51272). | ||
Penicillin + Streptomycin | Gibco | 15140122 | |
Plasmid purification kit | Invitrogen | PureLink HiPure plasmid midiprep kit (K210005) | |
pPB-CAG-LNL-RFP | CAG-LNL cassette from pCALNL-DsRed (a gift from Connie Cepko, Addgene #13769), and TurboRFP cDNA (Evrogen, FP232) were inserted into the cloning site of pPB-CAG.EBNXN (a gift from Sanger Institute). | ||
pPB-CAG-rDIO-EGFP | The sequence containning synthetic rox sites, synthetic DIO cassette, and EGFP cDNA from pEGFP-N1 (Clontech, U55762) in reverse direction were inserted into the cloning site of pPB-CAG.EBNXN (a gift from Sanger Institute). The sequence is provided in the Supplementary File. | ||
Puller | Narishige | PN-31 | |
StackRed | a plugin for ImageJ | http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/stackreg/ | |
Suture needle | Nazme | C-24-521-R No.1 | 1/2 circle, length 14 mm |
Suture thread | Nazme | C-23-B2 | Silk, size 5-0 |
Timed pregnant ICR (wild-type) mice | Japan SLC | ICR mouse | |
TrackMate | https://imagej.net/plugins/trackmate/index | ||
Tweezer-type electrode | BEX or NEPA Gene | CUY650P5 | |
Tα1-EGFP | EGFP cDNA from pEGFP-N1 (Clontech, U55762) was inserted into the downstream of the Tα1 promoter in plasmid 253 (a gift from P. Barker and F.D.Miller) | ||
Vibrating microtome | Leica or Zeiss | Vibrating blade microtome VT1000S or Hyrax V50. |