Summary

Imaging time-lapse di neuroni in migrazione e progenitori gliali in fette di cervello embrionale di topo

Published: March 08, 2024
doi:

Summary

Durante lo sviluppo della corteccia cerebrale, i neuroni e le cellule gliali hanno origine nella zona ventricolare che riveste il ventricolo e migrano verso la superficie del cervello. Molti geni sono coinvolti in questo processo. Questo protocollo introduce la tecnica per l’imaging time-lapse di neuroni in migrazione e progenitori gliali.

Abstract

Durante lo sviluppo della corteccia cerebrale, i neuroni e le cellule gliali hanno origine nella zona ventricolare che riveste il ventricolo e migrano verso la superficie del cervello. Questo processo è fondamentale per il corretto funzionamento del cervello e la sua disregolazione può provocare disturbi dello sviluppo neurologico e psichiatrici dopo la nascita. Infatti, è stato scoperto che molti geni responsabili di queste malattie sono coinvolti in questo processo, e quindi, rivelare come queste mutazioni influenzano la dinamica cellulare è importante per comprendere la patogenesi di queste malattie. Questo protocollo introduce una tecnica per l’imaging time-lapse di neuroni migratori e progenitori gliali in fette di cervello ottenute da embrioni di topo. Le cellule sono marcate con proteine fluorescenti utilizzando l’elettroporazione in utero , che visualizza le singole cellule che migrano dalla zona ventricolare con un alto rapporto segnale/rumore. Inoltre, questo sistema di trasferimento genico in vivo ci permette di eseguire facilmente esperimenti di guadagno o perdita di funzione su determinati geni mediante co-elettroporazione dei loro vettori di espressione o knockdown/knockout. Utilizzando questo protocollo, è possibile analizzare il comportamento migratorio e la velocità di migrazione delle singole cellule, informazioni che non vengono mai ottenute da cervelli fissi.

Introduction

Durante lo sviluppo della corteccia cerebrale, la glia radiale (apicale) nella zona ventricolare palliale (VZ) che riveste il ventricolo laterale produce prima neuroni e poi progenitori gliali con un periodo di sovrapposizione1. I neuroni sono generati anche da progenitori intermedi o glia radiale basale nella zona subventricolare (SVZ) adiacente alla VZ, entrambi originati dalla glia radiale (apicale) 2,3. Nei topi, le cellule gliali radiali producono solo neuroni nel giorno embrionale (E) 12-14, sia neuroni che progenitori gliali in E15-16 e progenitori gliali da E17 in poi4. La maggior parte della popolazione di progenitori gliali generati durante questi stadi embrionali si differenzia preferenzialmente in astrociti, sebbene alcune cellule si differenzino anche in oligodendrociti5. I neuroni e i progenitori degli astrociti generati in queste fasi migrano verso la superficie cerebrale ed entrano nella placca corticale (futura materia grigia corticale). La migrazione neuronale dalla VZ alla placca corticale avviene in più fasi. I neuroni adottano inizialmente una morfologia multipolare appena sopra la zona di accumulo cellulare multipolare (MAZ), sovrapponendosi alla SVZ o zona intermedia, dove estendono e ritraggono vigorosamente più processi sottili e migrano lentamente (migrazione multipolare)6,7. Dopo circa 24 ore, i neuroni si trasformano in una morfologia bipolare, estendendo un processo di guida spesso verso la superficie cerebrale e un processo di trascinamento sottile all’indietro, e migrano linearmente verso la superficie cerebrale utilizzando un processo radiale che si estende dalla glia radiale alla superficie piale come un’impalcatura, che è chiamata modalità di locomozione 2,8. Poiché i neuroni in modalità locomozione raggiungono sempre la superficie più esterna della placca corticale, passando attraverso i loro predecessori appena sotto la zona marginale, i neuroni sono allineati in modo dipendente dalla data di nascita dall’interno verso l’esterno nella placca corticale 9,10,11.

Al contrario, i progenitori degli astrociti migrano rapidamente verso la zona intermedia e la placca corticale, con frequenti cambiamenti direzionali. Questo comportamento migratorio è completamente diverso dalla migrazione neuronale ed è chiamato migrazione erratica5. I progenitori degli astrociti migrano anche lungo i vasi sanguigni in un processo chiamato migrazione guidata dai vasi sanguigni. I progenitori degli astrociti passano da una modalità di migrazione all’altra e raggiungono la placca corticale 5,12. Sebbene il posizionamento degli astrociti non sia strettamente determinato dalla loro data di produzione, è stata osservata una lieve tendenza degli astrociti precoci a stabilirsi nella parte superficiale della placca corticale5. È interessante notare che gli astrociti che si depositano nella placca corticale sono generati in stadi embrionali e alla fine si differenziano in astrociti protoplasmatici, mentre gli astrociti generati postnatale non migrano attivamente, rimangono nella sostanza bianca e si differenziano in astrociti fibrosi5. Come si verifichi questa specificazione stadio-dipendente dei sottotipi astrocitici rimane poco chiaro.

È stato identificato un numero crescente di geni coinvolti nella migrazione neuronale, compresi quelli coinvolti nei disturbi dello sviluppo neurologico e psichiatrici13,14. Pertanto, è fondamentale chiarire gli effetti delle mutazioni in questi geni sul comportamento dei neuroni migratori. Come accennato in precedenza, la migrazione neuronale avviene in più fasi. Le osservazioni time-lapse possono determinare direttamente la fase che viene maggiormente interessata (uscita dal ciclo cellulare, transizione multipolare-bipolare, velocità di migrazione della locomozione, ecc.). Tuttavia, i meccanismi molecolari alla base della specificazione, della migrazione e del posizionamento degli astrociti rimangono in gran parte sconosciuti. Dato che gli astrociti svolgono un ruolo cruciale nella sinaptogenesi15 e nella formazione della barriera emato-encefalica durante lo sviluppo del cervello16, i difetti di sviluppo negli astrociti possono causare disturbi dello sviluppo neurologico. Studi time-lapse sui progenitori degli astrociti possono chiarire questi meccanismi molecolari e la loro relazione con la malattia mentale.

Questo protocollo fornisce un metodo per l’osservazione in time-lapse di cellule corticali derivate da VZ. Un protocollo video simile per l’osservazione della migrazione neuronale è già stato pubblicato17. Qui, descriviamo il metodo sia per i neuroni migratori che per i progenitori degli astrociti. Per marcare queste cellule con proteine fluorescenti, come le proteine fluorescenti verdi e rosse (GFP e RFP), miscele plasmidi contenenti componenti appropriati vengono introdotte nella VZ corticale mediante elettroporazione in utero agli stadi appropriati 18,19,20,21. Gli embrioni manipolati vengono rimossi nelle fasi desiderate e i cervelli vengono affettati e utilizzati per osservazioni time-lapse utilizzando un microscopio a scansione laser. La velocità di migrazione, la direzione e altri comportamenti, che non vengono mai affrontati utilizzando campioni di cervello fissi, possono essere esaminati utilizzando questo metodo. Utilizzando l’elettroporazione in utero, l’espressione e i vettori knockdown/knockout possono essere facilmente trasferiti in concomitanza con vettori proteici fluorescenti, consentendoci di condurre studi di guadagno di funzione e perdita di funzione di geni specifici.

Protocol

Il presente studio è stato condotto con l’approvazione e seguendo le linee guida del Comitato per la cura e l’uso degli animali dell’Istituto per la ricerca sullo sviluppo, del Centro per la disabilità dello sviluppo di Aichi (#2019-013) e dell’Università di Keio (A2021-030). Topi ICR (wild-type) gravidi temporizzati sono stati ottenuti commercialmente (vedi Tabella dei materiali). Per osservare la relazione tra le cellule in migrazione e i vasi sanguigni, sono stati utilizzati topi Flt1-DsRed, in cu…

Representative Results

Le cellule gliali radiali nel VZ palliale producono solo neuroni fino a E14, e sia i neuroni che le cellule gliali a E15 ed E16. Per osservare contemporaneamente i comportamenti migratori dei neuroni e delle cellule gliali, li abbiamo marcati con GFP potenziata (EGFP) e RFP, rispettivamente, utilizzando un promotore neurone-specifico, il promotore Tα127 e il promotore28 della proteina acida fibrillare gliale umana (hGFAP), che è preferenzialmente attivato negli a…

Discussion

Questo protocollo ha introdotto un metodo per l’osservazione in time-lapse di cellule derivate dal VZ palliale (corticale). Per marcare le cellule in migrazione dal VZ, abbiamo utilizzato l’elettroporazione in utero, in cui le singole cellule sono state chiaramente marcate con un rapporto segnale/rumore più elevato rispetto alla marcatura mediata da vettori virali. Utilizzando l’elettroporazione in utero, qualsiasi tipo di vettore in qualsiasi combinazione può essere facilmente introdotto nelle cellul…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Il promotoreT α1 è un dono di P. Barker e F.D. Miller. Il promotore Dcx è un regalo di Q. Lu. hGFAP-Cre è stato un dono di Albee Messing. Il sistema vettoriale di trasposone PiggyBac è stato fornito dal Sanger Institute. I topi Flt1-DsRed sono stati forniti da M. Ema (Shiga University). Questo lavoro è stato sostenuto da JSPS KAKENHI (Grant Number JP21K07309 a H. Tabata, JP20H05688 e JP22K19365 a K. Nakajima) e Takeda Science Foundation, Keio Gijuku Fukuzawa Memorial Fund for the Advancement of Education and Research, Keio Gijuku Academic Development Funds a K. Nakajima.

Materials

Aspirator tube assembly Drummond 2-040-000
Atipamezole (5 mg/mL) Meiji Mepatia
Autoclip Becton Dickinson 427630 9 mm
B27 supplement Gibco 17504-044
Butorphanol (5 mg/mL) Meiji Vetorphale
Cell culture insert Millipore PICM ORG 50
Confocal microscope Nikon A1RHD25 Equipped with a long working distance lens (S Plan Fluor ELWD 20XC)
Cryomold Tissue-Tek 4566
Culture chamber Tokken TK-NBCMP Custom-made
Electroporator NEPA Gene NEPA21
Fast Green Sigma-Aldrich F7258
Gas mixer Tokken TK-MIGM01-02
Glass base dish Iwaki 3910-035 Diameter of glass base is 27 mm
Glass capillaries Narishige GD-1
HBS (2x) Sigma-Aldrich 51558
HBSS(-) Wako 084-08345
Heater Unit Tokken TK-0003HU20 Custom-made, including hood and heater
hGFAP-Cre Addgene #40591 A gift from Albee Messing
ImageJ https://imagej.net/ij/
L-glutamine (200 mM) Gibco 25030
Low melting temperature agarose Lonza 50100
Medetomidine (1 mg/mL) Meiji Medetomin
Microinjector Narishige IM-300
Midazolam (5 mg/mL) Sandoz Midazolam
MTrackJ https://imagescience.org/meijering/software/mtrackj/
Neurobasal medium Gibco 21103-049
pCAG-hyPBase The hyPBase cDNA from pCMV-hyPBase (a gift from Sanger Institute) was inserted into the downstream of the CAG promoter of pCAGGS (a gift from J. Miyazaki).
pDcx-Dre The Dcx promoter from Dcx4kbEGFP70 (a gift from Q. Lu) was exchanged with CAG promoter of pCAG-NLS-HA-Dre34 (a gift from Pawel Pelczar, Addgene #51272).
Penicillin + Streptomycin Gibco 15140122
Plasmid purification kit Invitrogen PureLink HiPure plasmid midiprep kit (K210005)
pPB-CAG-LNL-RFP CAG-LNL cassette from pCALNL-DsRed (a gift from Connie Cepko, Addgene #13769), and TurboRFP cDNA (Evrogen, FP232) were inserted into the cloning site of pPB-CAG.EBNXN (a gift from Sanger Institute).
pPB-CAG-rDIO-EGFP The sequence containning synthetic rox sites, synthetic DIO cassette, and EGFP cDNA from pEGFP-N1 (Clontech, U55762) in reverse direction  were inserted into the cloning site of pPB-CAG.EBNXN (a gift from Sanger Institute). The sequence is provided in the Supplementary File.
Puller Narishige PN-31
StackRed a plugin for ImageJ http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/stackreg/
Suture needle Nazme C-24-521-R No.1 1/2 circle, length 14 mm
Suture thread Nazme C-23-B2 Silk, size 5-0
Timed pregnant ICR (wild-type) mice Japan SLC ICR mouse
TrackMate https://imagej.net/plugins/trackmate/index
Tweezer-type electrode BEX or NEPA Gene CUY650P5 
Tα1-EGFP EGFP cDNA from pEGFP-N1 (Clontech, U55762) was inserted into the downstream of the Tα1 promoter in plasmid 253 (a gift from P. Barker and F.D.Miller)
Vibrating microtome Leica or Zeiss Vibrating blade microtome VT1000S or Hyrax V50.

References

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Tabata, H., Nagata, K., Nakajima, K. Time-Lapse Imaging of Migrating Neurons and Glial Progenitors in Embryonic Mouse Brain Slices. J. Vis. Exp. (205), e66631, doi:10.3791/66631 (2024).

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