Imágenes de lapso de tiempo de neuronas migratorias y progenitores gliales en cortes de cerebro de ratón embrionario

Durante el desarrollo de la corteza cerebral, la glía radial (apical) en la zona ventricular paleal (VZ) que recubre el ventrículo lateral produce primero neuronas y luego progenitores gliales con algún período de superposición¹. Las neuronas también se generan a partir de progenitores intermedios o glía radial basal en la zona subventricular (SVZ) adyacente a la VZ, los cuales se originan en la glía radial (apical) ^2,3. En ratones, las células gliales radiales producen solo neuronas en el día embrionario (E) 12-14, tanto neuronas como progenitores gliales en E15-16, y progenitores gliales a partir de E17⁴. La mayor población de progenitores gliales generados durante estas etapas embrionarias se diferencia preferentemente en astrocitos, aunque algunas células también se diferencian en oligodendrocitos⁵. Las neuronas y los progenitores de astrocitos generados en estas etapas migran hacia la superficie del cerebro y entran en la placa cortical (futura materia gris cortical). La migración neuronal de la VZ a la placa cortical se produce en múltiples fases. Las neuronas primero adoptan una morfología multipolar justo por encima de la zona de acumulación celular multipolar (MAZ), superponiéndose a la SVZ o zona intermedia, donde se extienden y retraen vigorosamente múltiples procesos delgados y migran lentamente (migración multipolar)^6,7. Después de aproximadamente 24 h, las neuronas se transforman en una morfología bipolar, extendiendo un proceso de avance grueso hacia la superficie del cerebro y un proceso de arrastre delgado hacia atrás, y migran linealmente hacia la superficie del cerebro utilizando un proceso radial que se extiende desde la glía radial hasta la superficie pial como un andamio, que se denomina modo de locomoción ^2,8. Debido a que las neuronas en modo de locomoción siempre alcanzan la superficie más externa de la placa cortical, pasando a través de sus predecesoras justo debajo de la zona marginal, las neuronas se alinean de adentro hacia afuera dependiendo de la fecha de nacimiento en la placa cortical ^9,10,11.

Por el contrario, los progenitores de los astrocitos migran rápidamente a la zona intermedia y a la placa cortical, con frecuentes cambios de dirección. Este comportamiento migratorio es completamente diferente a la migración neuronal y se denomina migración errática⁵. Los progenitores de astrocitos también migran a lo largo de los vasos sanguíneos en un proceso llamado migración guiada por los vasos sanguíneos. Los progenitores de astrocitos cambian entre estos modos de migración y alcanzan la placa cortical ^5,12. A pesar de que la posición de los astrocitos no está estrictamente determinada por su fecha de producción, se ha observado una leve tendencia de los astrocitos nacidos temprano a establecerse en la parte superficial de la placa cortical⁵. Curiosamente, los astrocitos que se asientan en la placa cortical se generan en etapas embrionarias y eventualmente se diferencian en astrocitos protoplasmáticos, mientras que los astrocitos generados postnatalmente no migran activamente, permanecen en la sustancia blanca y se diferencian en astrocitos fibrosos⁵. Todavía no está claro cómo se produce esta especificación dependiente de la etapa de los subtipos astrocíticos.

Se ha identificado un número creciente de genes implicados en la migración neuronal, entre ellos los implicados en los trastornos del neurodesarrollo y psiquiátricos^13,14. Por lo tanto, es crucial dilucidar los efectos de las mutaciones en estos genes en el comportamiento de las neuronas migratorias. Como se mencionó anteriormente, la migración neuronal ocurre en múltiples fases. Las observaciones time-lapse pueden determinar directamente la fase que se ve principalmente afectada (salida del ciclo celular, transición multipolar-bipolar, velocidad de migración de la locomoción, etcétera). Sin embargo, los mecanismos moleculares que subyacen a la especificación, migración y posicionamiento de los astrocitos siguen siendo en gran medida desconocidos. Dado que los astrocitos desempeñan un papel crucial en la sinaptogénesis¹⁵ y en la formación de barreras hematoencefálicas durante el desarrollo del cerebro¹⁶, los defectos del desarrollo de los astrocitos pueden dar lugar a trastornos del neurodesarrollo. Los estudios de lapso de tiempo sobre los progenitores de astrocitos pueden aclarar estos mecanismos moleculares y su relación con las enfermedades mentales.

Este protocolo proporciona un método para la observación en lapso de tiempo de las células corticales derivadas de VZ. Ya se ha publicado un protocolo de vídeo similar para la observación de la migración neuronal¹⁷. Aquí, describimos el método para las neuronas migratorias y los progenitores de astrocitos. Para marcar estas células con proteínas fluorescentes, como las proteínas fluorescentes verdes y rojas (GFP y RFP), se introducen mezclas de plásmidos que contienen componentes apropiados en la VZ cortical mediante electroporación en el útero en etapas apropiadas 18,19,20,21. Los embriones manipulados se extraen en las etapas deseadas, y los cerebros se cortan y se utilizan para observaciones de lapso de tiempo utilizando un microscopio de escaneo láser. La velocidad de migración, la dirección y otros comportamientos, que nunca se abordan con muestras fijas de cerebro, se pueden examinar con este método. Mediante el uso de electroporación en el útero, la expresión y los vectores knockdown/knockout pueden transferirse fácilmente de forma concomitante con vectores de proteínas fluorescentes, lo que nos permite realizar estudios de ganancia y pérdida de función de genes específicos.