Imagem de lapso de tempo de neurônios migratórios e progenitores gliais em fatias de cérebro de camundongo embrionário

Durante o desenvolvimento do córtex cerebral, a glia radial (apical) na zona ventricular palial (VZ) que reveste o ventrículo lateral produz primeiro neurônios e depois progenitores gliais com algum período de sobreposição¹. Os neurônios também são gerados a partir de progenitores intermediários ou glia radial basal na zona subventricular (SVZ) adjacente à VZ, ambas originadas da glia radial (apical) ^2,3. Em camundongos, as células gliais radiais produzem apenas neurônios no dia embrionário (E) 12-14, neurônios e progenitores gliais em E15-16 e progenitores gliais de E17 em diante⁴. A maior população de progenitores gliais gerada durante esses estágios embrionários se diferencia preferencialmente em astrócitos, embora algumas células também se diferenciem em oligodendrócitos⁵. Neurônios e progenitores de astrócitos gerados nesses estágios migram em direção à superfície do cérebro e entram na placa cortical (futura substância cinzenta cortical). A migração neuronal da VZ para a placa cortical ocorre em várias fases. Os neurônios adotam primeiro uma morfologia multipolar logo acima da zona de acumulação celular multipolar (MAZ), sobrepondo-se à SVZ ou zona intermediária, onde se estendem e retraem vigorosamente vários processos finos e migram lentamente (migração multipolar) ^{6 , 7} . Após aproximadamente 24 h, os neurônios se transformam em uma morfologia bipolar, estendendo um processo principal espesso em direção à superfície do cérebro e um processo de rastreamento fino para trás, e migram linearmente em direção à superfície do cérebro usando um processo radial que se estende da glia radial à superfície pial como um andaime, que é chamado de modo de locomoção ^2,8. Como os neurônios em modo de locomoção sempre atingem a superfície mais externa da placa cortical, passando por seus predecessores logo abaixo da zona marginal, os neurônios são alinhados de dentro para fora dependentes da data de nascimento na placa cortical ^9,10,11.

Em contraste, os progenitores dos astrócitos migram rapidamente para a zona intermediária e a placa cortical, com frequentes mudanças direcionais. Esse comportamento migratório é completamente diferente da migração neuronal e é chamado de migração errática⁵. Os progenitores dos astrócitos também migram ao longo dos vasos sanguíneos em um processo chamado migração guiada pelos vasos sanguíneos. Os progenitores dos astrócitos alternam entre esses modos de migração e atingem a placa cortical ^5,12. Embora o posicionamento dos astrócitos não seja estritamente determinado pela data de produção, foi observada uma tendência leve de os astrócitos nascidos precocemente se estabelecerem na parte superficial da placa cortical⁵. Curiosamente, os astrócitos que se instalam na placa cortical são gerados em estágios embrionários e eventualmente se diferenciam em astrócitos protoplasmáticos, enquanto os astrócitos gerados no pós-natal não migram ativamente, permanecem na substância branca e se diferenciam em astrócitos fibrosos⁵. Como essa especificação dependente do estágio dos subtipos astrocíticos ocorre ainda não está claro.

Um número crescente de genes envolvidos na migração neuronal foi identificado, incluindo aqueles envolvidos em distúrbios do neurodesenvolvimento e psiquiátricos^13,14. Portanto, é crucial elucidar os efeitos de mutações nesses genes sobre o comportamento dos neurônios migratórios. Como mencionado anteriormente, a migração neuronal ocorre em várias fases. As observações de lapso de tempo podem determinar diretamente a fase mais afetada (saída do ciclo celular, transição multipolar-bipolar, velocidade de migração da locomoção, etc.). No entanto, os mecanismos moleculares subjacentes à especificação, migração e posicionamento dos astrócitos permanecem amplamente desconhecidos. Dado que os astrócitos desempenham papéis cruciais na sinaptogênese¹⁵ e na formação da barreira hematoencefálica durante o desenvolvimento do cérebro¹⁶, os defeitos de desenvolvimento nos astrócitos podem resultar em distúrbios do neurodesenvolvimento. Estudos de lapso de tempo em progenitores de astrócitos podem esclarecer esses mecanismos moleculares e sua relação com doenças mentais.

Este protocolo fornece um método para observação de lapso de tempo de células corticais derivadas de VZ. Um protocolo de vídeo semelhante para a observação da migração neuronal já foi publicado¹⁷. Aqui, descrevemos o método para neurônios migratórios e progenitores de astrócitos. Para marcar essas células com proteínas fluorescentes, como proteínas fluorescentes verdes e vermelhas (GFP e RFP), misturas de plasmídeos contendo componentes apropriados são introduzidas na VZ cortical por eletroporação in utero em estágios apropriados 18,19,20,21. Os embriões manipulados são removidos nos estágios desejados e os cérebros são fatiados e usados para observações de lapso de tempo usando um microscópio de varredura a laser. A velocidade de migração, direção e outros comportamentos, que nunca são abordados usando amostras cerebrais fixas, podem ser examinados usando este método. Usando eletroporação in utero, expressão e vetores knockdown/knockout podem ser facilmente transferidos concomitantemente com vetores de proteínas fluorescentes, permitindo-nos realizar estudos de ganho de função e perda de função de genes específicos.