דימות בהילוך מהיר של נוירונים נודדים ואבות גלייה בפרוסות מוח עובריות של עכבר
Summary
במהלך התפתחות קליפת המוח, נוירונים ותאי גלייה מקורם באזור החדר המצפה את החדר ונודדים לעבר פני המוח. גנים רבים מעורבים בתהליך זה. פרוטוקול זה מציג את הטכניקה לדימות בהילוך מהיר של נוירונים נודדים ואבות גלייה.
Abstract
במהלך התפתחות קליפת המוח, נוירונים ותאי גלייה מקורם באזור החדר המצפה את החדר ונודדים לעבר פני המוח. תהליך זה חיוני לתפקוד תקין של המוח, וחוסר ויסות שלו עלול לגרום להפרעות נוירו-התפתחותיות ופסיכיאטריות לאחר הלידה. למעשה, גנים רבים האחראים למחלות אלה נמצאו מעורבים בתהליך זה, ולכן חשיפת האופן שבו מוטציות אלה משפיעות על הדינמיקה התאית חשובה להבנת הפתוגנזה של מחלות אלה. פרוטוקול זה מציג טכניקה לדימות בהילוך מהיר של נוירונים נודדים ואבות גלייה בפרוסות מוח המתקבלות מעוברי עכברים. תאים מסומנים בחלבונים פלואורסצנטיים באמצעות אלקטרופורציה ברחם , המדמה תאים בודדים הנודדים מאזור החדר עם יחס אות לרעש גבוה. יתר על כן, מערכת העברת גנים in vivo זו מאפשרת לנו לבצע בקלות ניסויים של רווח תפקוד או אובדן תפקוד על הגנים הנתונים על ידי אלקטרופורציה משותפת של הביטוי שלהם או וקטורים knockdown/knockout. באמצעות פרוטוקול זה ניתן לנתח את התנהגות הנדידה ומהירות הנדידה של תאים בודדים, מידע שלעולם אינו מתקבל ממוחות קבועים.
Introduction
במהלך התפתחות קליפת המוח, גליה רדיאלית (אפיקלית) באזור החדר הפליאלי (VZ) המצפה את החדר הצידי מייצרת תחילה נוירונים ולאחר מכן אבות גליה עם תקופה חופפתכלשהי 1. תאי עצב נוצרים גם מאבות ביניים או מתאי גליה רדיאליים בסיסיים באזור התת-חדרי (SVZ) הסמוך ל-VZ, שניהם נובעים מהגליה הרדיאלית (אפיקלית) 2,3. בעכברים, תאי גליה רדיאליים מייצרים רק תאי עצב ביום העוברי (E) 12-14, גם תאי עצב וגם אבות גלייה ב-E15-16, ואבות גלייה מ-E17 ואילך4. האוכלוסייה העיקרית של אבות גליה שנוצרו במהלך שלבים עובריים אלה מתמיינת באופן מועדף לאסטרוציטים, אם כי תאים מסוימים מתמיינים גם לאוליגודנדרוציטים5. תאי עצב ואבות אסטרוציטים הנוצרים בשלבים אלה נודדים לעבר פני השטח של המוח ונכנסים ללוח קליפת המוח (החומר האפור קליפת המוח העתידי). הגירה עצבית מה- VZ לצלחת קליפת המוח מתרחשת במספר שלבים. תאי עצב מאמצים תחילה מורפולוגיה רב-קוטבית ממש מעל אזור הצטברות התאים הרב-קוטביים (MAZ), החופפים את SVZ או אזור הביניים, שם הם מאריכים במרץ ונסוגים תהליכים דקים מרובים ונודדים לאט (נדידה רב-קוטבית)6,7. לאחר כ-24 שעות, תאי עצב הופכים למורפולוגיה דו-קוטבית, המאריכה תהליך מוביל עבה לעבר פני השטח של המוח ותהליך נגרר דק לאחור, ונודדים באופן ליניארי לעבר פני השטח של המוח באמצעות תהליך רדיאלי הנמשך מהגליה הרדיאלית אל פני השטח של הפיאל כפיגום, הנקרא מצב תנועה 2,8. מאחר שתאי עצב במצב תנועה תמיד מגיעים לפני השטח החיצוניים ביותר של לוח קליפת המוח, ועוברים דרך קודמיהם ממש מתחת לאזור השוליים, תאי עצב מיושרים באופן תלוי תאריך לידה מבפנים החוצה בלוח קליפת המוח 9,10,11.
לעומת זאת, אבות אסטרוציטים נודדים במהירות לאזור הביניים וללוח קליפת המוח, עם שינויי כיוון תכופים. התנהגות הגירה זו שונה לחלוטין מהגירה עצבית ונקראת הגירה לא יציבה5. אבות אסטרוציטים נודדים גם לאורך כלי הדם בתהליך שנקרא נדידה מונחית כלי דם. אבות אסטרוציטים עוברים בין מצבי נדידה אלה ומגיעים ללוח קליפת המוח 5,12. למרות המיקום של אסטרוציטים אינו נקבע בקפידה על ידי תאריך הייצור שלהם, נטייה קלה עבור אסטרוציטים שנולדו מוקדם להתיישב בחלק השטחי של צלחת קליפת המוח נצפתה5. באופן מעניין, אסטרוציטים המתיישבים בלוח קליפת המוח נוצרים בשלבים עובריים ובסופו של דבר מתמיינים לאסטרוציטים פרוטופלסמיים, בעוד שאסטרוציטים שנוצרו לאחר הלידה אינם נודדים באופן פעיל, נשארים בחומר הלבן ומתמיינים לאסטרוציטים סיביים5. כיצד מתרחש מפרט תלוי שלב זה של תת-סוגים אסטרוציטיים עדיין אינו ברור.
מספר גדל והולך של גנים המעורבים בהגירה עצבית זוהו, כולל אלה המעורבים בהפרעות נוירו-התפתחותיות ופסיכיאטריות13,14. לכן, חיוני להבהיר את ההשפעות של מוטציות בגנים אלה על ההתנהגות של נוירונים נודדים. כאמור, הגירה עצבית מתרחשת במספר שלבים. תצפיות בהילוך מהיר יכולות לקבוע ישירות את השלב המושפע בעיקר (יציאת מחזור התא, מעבר רב-קוטבי-דו-קוטבי, מהירות נדידה של תנועה וכו ‘). עם זאת, המנגנונים המולקולריים העומדים בבסיס המפרט, ההגירה והמיקום של אסטרוציטים עדיין אינם ידועים במידה רבה. בהתחשב בכך שאסטרוציטים ממלאים תפקידים מכריעים בסינפטוגנזה15 ובהיווצרות מחסום דם-מוח במהלך התפתחות המוח16, פגמים התפתחותיים באסטרוציטים עלולים לגרום להפרעות נוירו-התפתחותיות. מחקרים בהילוך מהיר על אבות אסטרוציטים עשויים להבהיר מנגנונים מולקולריים אלה ואת הקשר שלהם עם מחלות נפש.
פרוטוקול זה מספק שיטה לתצפית בהילוך מהיר של תאים שמקורם בקליפת המוח VZ. פרוטוקול וידאו דומה לתצפית על הגירה עצבית כבר פורסם17. במאמר זה אנו מתארים את השיטה הן עבור תאי עצב נודדים והן עבור אבות אסטרוציטים. כדי לתייג תאים אלה עם חלבונים פלואורסצנטיים, כגון חלבונים פלואורסצנטיים ירוקים ואדומים (GFP ו- RFP), תערובות פלסמיד המכילות רכיבים מתאימים מוכנסות לתוך VZ קליפת המוח על ידי אלקטרופורציה ברחם בשלבים המתאימים 18,19,20,21. העוברים שעברו מניפולציה מוסרים בשלבים הרצויים, והמוח נחתך ומשמש לתצפיות בהילוך מהיר באמצעות מיקרוסקופ סריקת לייזר. את מהירות הנדידה, הכיוון והתנהגויות אחרות, שלעולם אינן מטופלות באמצעות דגימות מוח קבועות, ניתן לבחון באמצעות שיטה זו. שימוש באלקטרופורציה ברחם, ביטוי ווקטורים של הדחה/נוקאאוט יכולים להיות מועברים בקלות במקביל לווקטורים של חלבונים פלואורסצנטיים, מה שמאפשר לנו לבצע מחקרי רווח תפקוד ואובדן תפקוד של גנים ספציפיים.
Protocol
Representative Results
Discussion
פרוטוקול זה הציג שיטה לתצפית בהילוך מהיר של תאים שמקורם ב- VZ הפליאלי (קליפת המוח). כדי לתייג את התאים הנודדים מה-VZ, השתמשנו באלקטרופורציה ברחם, שבה תאים בודדים סומנו בבירור עם יחס אות לרעש גבוה יותר מאשר בתיוג וקטורי נגיפי. באמצעות אלקטרופורציה ברחם, כל סוג של וקטור בכל שילוב יכול ל…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Tα1 promoter הוא מתנה מ P. Barker ו F.D. מילר. מקדם Dcx הוא מתנה מ Q. Lu. hGFAP-Cre היה מתנה מאלבי מסינג. מערכת וקטורי הטרנספוזון PiggyBac סופקה על ידי מכון סנגר. עכברי Flt1-DsRed סופקו על ידי M. Ema (אוניברסיטת שיגה). עבודה זו נתמכה על ידי JSPS KAKENHI (מענק מספר JP21K07309 ל- H. Tabata, JP20H05688 ו- JP22K19365 ל- K. Nakajima) וקרן המדע טקדה, קרן הזיכרון Keio Gijuku Fukuzawa לקידום החינוך והמחקר, Keio Gijuku Academic Development Fund ל- K. Nakajima.
Materials
| Aspirator tube assembly | Drummond | 2-040-000 | |
| Atipamezole (5 mg/mL) | Meiji | Mepatia | |
| Autoclip | Becton Dickinson | 427630 | 9 mm |
| B27 supplement | Gibco | 17504-044 | |
| Butorphanol (5 mg/mL) | Meiji | Vetorphale | |
| Cell culture insert | Millipore | PICM ORG 50 | |
| Confocal microscope | Nikon | A1RHD25 | Equipped with a long working distance lens (S Plan Fluor ELWD 20XC) |
| Cryomold | Tissue-Tek | 4566 | |
| Culture chamber | Tokken | TK-NBCMP | Custom-made |
| Electroporator | NEPA Gene | NEPA21 | |
| Fast Green | Sigma-Aldrich | F7258 | |
| Gas mixer | Tokken | TK-MIGM01-02 | |
| Glass base dish | Iwaki | 3910-035 | Diameter of glass base is 27 mm |
| Glass capillaries | Narishige | GD-1 | |
| HBS (2x) | Sigma-Aldrich | 51558 | |
| HBSS(-) | Wako | 084-08345 | |
| Heater Unit | Tokken | TK-0003HU20 | Custom-made, including hood and heater |
| hGFAP-Cre | Addgene | #40591 | A gift from Albee Messing |
| ImageJ | https://imagej.net/ij/ | ||
| L-glutamine (200 mM) | Gibco | 25030 | |
| Low melting temperature agarose | Lonza | 50100 | |
| Medetomidine (1 mg/mL) | Meiji | Medetomin | |
| Microinjector | Narishige | IM-300 | |
| Midazolam (5 mg/mL) | Sandoz | Midazolam | |
| MTrackJ | https://imagescience.org/meijering/software/mtrackj/ | ||
| Neurobasal medium | Gibco | 21103-049 | |
| pCAG-hyPBase | The hyPBase cDNA from pCMV-hyPBase (a gift from Sanger Institute) was inserted into the downstream of the CAG promoter of pCAGGS (a gift from J. Miyazaki). | ||
| pDcx-Dre | The Dcx promoter from Dcx4kbEGFP70 (a gift from Q. Lu) was exchanged with CAG promoter of pCAG-NLS-HA-Dre34 (a gift from Pawel Pelczar, Addgene #51272). | ||
| Penicillin + Streptomycin | Gibco | 15140122 | |
| Plasmid purification kit | Invitrogen | PureLink HiPure plasmid midiprep kit (K210005) | |
| pPB-CAG-LNL-RFP | CAG-LNL cassette from pCALNL-DsRed (a gift from Connie Cepko, Addgene #13769), and TurboRFP cDNA (Evrogen, FP232) were inserted into the cloning site of pPB-CAG.EBNXN (a gift from Sanger Institute). | ||
| pPB-CAG-rDIO-EGFP | The sequence containning synthetic rox sites, synthetic DIO cassette, and EGFP cDNA from pEGFP-N1 (Clontech, U55762) in reverse direction were inserted into the cloning site of pPB-CAG.EBNXN (a gift from Sanger Institute). The sequence is provided in the Supplementary File. | ||
| Puller | Narishige | PN-31 | |
| StackRed | a plugin for ImageJ | http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/stackreg/ | |
| Suture needle | Nazme | C-24-521-R No.1 | 1/2 circle, length 14 mm |
| Suture thread | Nazme | C-23-B2 | Silk, size 5-0 |
| Timed pregnant ICR (wild-type) mice | Japan SLC | ICR mouse | |
| TrackMate | https://imagej.net/plugins/trackmate/index | ||
| Tweezer-type electrode | BEX or NEPA Gene | CUY650P5 | |
| Tα1-EGFP | EGFP cDNA from pEGFP-N1 (Clontech, U55762) was inserted into the downstream of the Tα1 promoter in plasmid 253 (a gift from P. Barker and F.D.Miller) | ||
| Vibrating microtome | Leica or Zeiss | Vibrating blade microtome VT1000S or Hyrax V50. |
References
- Kriegstein, A., Alvarez-Buylla, A. The glial nature of embryonic and adult neural stem cells. Annu Rev Neurosci. 32 (1), 149-184 (2009).
- Noctor, S. C., Martínez-Cerdeño, V., Ivic, L., Kriegstein, A. R. Cortical neurons arise in symmetric and asymmetric division zones and migrate through specific phases. Nat Neurosci. 7 (2), 136-144 (2004).
- Haubensak, W., Attardo, A., Denk, W., Huttner, W. B. Neurons arise in the basal neuroepithelium of the early mammalian telencephalon: A major site of neurogenesis. P Natl Acad Sci USA. 101 (9), 3196-3201 (2004).
- Yoshida, A., Yamaguchi, Y., Nonomura, K., Kawakami, K., Takahashi, Y., Miura, M. Simultaneous expression of different transgenes in neurons and glia by combining in utero electroporation with the Tol2 transposon-mediated gene transfer system. Genes Cells. 15 (5), 501-512 (2010).
- Tabata, H., et al. Erratic and blood vessel-guided migration of astrocyte progenitors in the cerebral cortex. Nat Commun. 13 (1), 6571 (2022).
- Tabata, H., Nakajima, K. Multipolar Migration: The third mode of radial neuronal migration in the developing cerebral cortex. J Neurosci. 23 (31), 9996-10001 (2003).
- Tabata, H., Kanatani, S., Nakajima, K. Differences of migratory behavior between direct progeny of apical progenitors and basal progenitors in the developing cerebral cortex. Cereb Cortex. 19 (9), 2092-2105 (2009).
- Rakic, P. Mode of cell migration to the superficial layers of fetal monkey neocortex. J Comp Neurol. 145 (1), 61-83 (1972).
- Sekine, K., Honda, T., Kawauchi, T., Kubo, K., Nakajima, K. The outermost region of the developing cortical plate is crucial for both the switch of the radial migration mode and the Dab1-dependent "inside-out" lamination in the neocortex. J Neurosci. 31 (25), 9426-9439 (2011).
- Shin, M., et al. Both excitatory and inhibitory neurons transiently form clusters at the outermost region of the developing mammalian cerebral neocortex. J Comp Neurol. 527 (10), 1577-1597 (2019).
- Sekine, K., et al. Reelin controls neuronal positioning by promoting cell-matrix adhesion via inside-out activation of integrin α5β1. Neuron. 76 (2), 353-369 (2012).
- Morimoto, K., Tabata, H., Takahashi, R., Nakajima, K. Interactions between neural cells and blood vessels in central nervous system development. BioEssays. 230091, (2023).
- Tabata, H., Nagata, K. Decoding the molecular mechanisms of neuronal migration using in utero electroporation. Med Mol Morphol. 49 (2), 63-75 (2016).
- Ishii, K., Kubo, K., Nakajima, K. Reelin and neuropsychiatric disorders. Front Cell Neurosci. 10, 229 (2016).
- Bosworth, A. P., Allen, N. J. The diverse actions of astrocytes during synaptic development. Curr Opin Neurobiol. 47, 38-43 (2017).
- Tabata, H. Crosstalk between blood vessels and glia during the central nervous system development. Life. 12 (11), 1761 (2022).
- Wiegreffe, C., Feldmann, S., Gaessler, S., Britsch, S. Time-lapse confocal imaging of migrating neurons in organotypic slice culture of embryonic mouse brain using in utero electroporation. J Vis Exp. (125), e55886 (2017).
- Saito, T., Nakatsuji, N. Efficient Gene Transfer into the Embryonic Mouse Brain Using in Vivo Electroporation. Dev Biol. 240 (1), 237-246 (2001).
- Tabata, H., Nakajima, K. Labeling embryonic mouse central nervous system cells by in utero electroporation. Dev Growth Differ. 50 (6), 507-511 (2008).
- Tabata, H., Nakajima, K. Efficient in utero gene transfer system to the developing mouse brain using electroporation: visualization of neuronal migration in the developing cortex. Neuroscience. 103 (4), 865-872 (2001).
- Fukuchi-Shimogori, T. Neocortex patterning by the secreted signaling molecule FGF8. Science. 294 (5544), 1071-1074 (2001).
- Matsumoto, K., et al. Study of normal and pathological blood vessel morphogenesis in Flt1-tdsRed BAC Tg mice. Genesis. 50 (7), 561-571 (2012).
- Kawai, S., Takagi, Y., Kaneko, S., Kurosawa, T. Effect of three types of mixed anesthetic agents alternate to ketamine in mice. Exp Anim. 60 (5), 481-487 (2011).
- Meijering, E., Dzyubachyk, O., Smal, I. Methods for cell and particle tracking. Methods Enzymol. 504, 183-200 (2012).
- Ershov, D., et al. TrackMate 7: Integrating state-of-the-art segmentation algorithms into tracking pipelines. Nat Methods. 19 (7), 829-832 (2022).
- Tinevez, J. -. Y., et al. TrackMate: An open and extensible platform for single-particle tracking. Methods. 115, 80-90 (2017).
- Gloster, A., et al. The T alpha 1 alpha-tubulin promoter specifies gene expression as a function of neuronal growth and regeneration in transgenic mice. J Neurosci. 14 (12), 7319-7330 (1994).
- Zhuo, L., et al. hGFAP-cre transgenic mice for manipulation of glial and neuronal function in vivo. Genesis. 31 (2), 85-94 (2001).
- Yusa, K., Zhou, L., Li, M. A., Bradley, A., Craig, N. L. A hyperactive piggyBac transposase for mammalian applications. P Natl Acad Sci USA. 108 (4), 1531-1536 (2011).
- Chen, F., LoTurco, J. A method for stable transgenesis of radial glia lineage in rat neocortex by piggyBac mediated transposition. J Neurosci Meth. 207 (2), 172-180 (2012).
- Wang, X., Qiu, R., Tsark, W., Lu, Q. Rapid promoter analysis in developing mouse brain and genetic labeling of young neurons by doublecortin-DsRed-express. J Neurosci Res. 85 (16), 3567-3573 (2007).
- Sauer, B. DNA recombination with a heterospecific Cre homolog identified from comparison of the pac-c1 regions of P1-related phages. Nucleic Acids Res. 32 (20), 6086-6095 (2004).
- Hermann, M., et al. Binary recombinase systems for high-resolution conditional mutagenesis. Nucleic Acids Res. 42 (6), 3894-3907 (2014).
- Kanatani, S., et al. The COUP-TFII/Neuropilin-2 is a molecular switch steering diencephalon-derived GABAergic neurons in the developing mouse brain. P Natl Acad Sci USA. 112 (36), E4985-E4994 (2015).
- Yozu, M., Tabata, H., Nakajima, K. The caudal migratory stream: A novel migratory stream of interneurons derived from the caudal ganglionic eminence in the developing mouse forebrain. J Neurosci. 25 (31), 7268-7277 (2005).
- Kanatani, S., Yozu, M., Tabata, H., Nakajima, K. COUP-TFII is preferentially expressed in the caudal ganglionic eminence and is involved in the caudal migratory stream. J Neurosci. 28 (50), 13582-13591 (2008).
- Kitazawa, A., et al. Hippocampal pyramidal neurons switch from a multipolar migration mode to a novel "climbing" migration mode during development. J Neurosci. 34 (4), 1115-1126 (2014).
