تصوير الفاصل الزمني للخلايا العصبية المهاجرة والأسلاف الدبقية في شرائح دماغ الفأر الجنينية
Summary
أثناء تطور القشرة الدماغية ، تنشأ الخلايا العصبية والخلايا الدبقية في منطقة البطين المبطنة للبطين وتهاجر نحو سطح الدماغ. تشارك العديد من الجينات في هذه العملية. يقدم هذا البروتوكول تقنية التصوير بفاصل زمني للخلايا العصبية المهاجرة والأسلاف الدبقية.
Abstract
أثناء تطور القشرة الدماغية ، تنشأ الخلايا العصبية والخلايا الدبقية في منطقة البطين المبطنة للبطين وتهاجر نحو سطح الدماغ. هذه العملية ضرورية لوظيفة الدماغ المناسبة ، ويمكن أن يؤدي عدم تنظيمها إلى اضطرابات النمو العصبي والنفسي بعد الولادة. في الواقع ، تم العثور على العديد من الجينات المسؤولة عن هذه الأمراض تشارك في هذه العملية ، وبالتالي ، فإن الكشف عن كيفية تأثير هذه الطفرات على الديناميات الخلوية أمر مهم لفهم التسبب في هذه الأمراض. يقدم هذا البروتوكول تقنية للتصوير بفاصل زمني للخلايا العصبية المهاجرة والأسلاف الدبقية في شرائح الدماغ التي تم الحصول عليها من أجنة الفئران. يتم تمييز الخلايا ببروتينات الفلورسنت باستخدام التثقيب الكهربائي في الرحم ، والذي يصور الخلايا الفردية المهاجرة من منطقة البطين بنسبة إشارة إلى ضوضاء عالية. علاوة على ذلك ، يتيح لنا نظام نقل الجينات في الجسم الحي إجراء تجارب اكتساب الوظيفة أو فقدان الوظيفة بسهولة على جينات معينة عن طريق التثقيب الكهربائي المشترك لتعبيرها أو نواقل الضربة القاضية / الضربة القاضية. باستخدام هذا البروتوكول ، يمكن تحليل سلوك الهجرة وسرعة هجرة الخلايا الفردية ، وهي معلومات لا يتم الحصول عليها أبدا من أدمغة ثابتة.
Introduction
أثناء تطور القشرة الدماغية ، تنتج الدبقية الكعبرية (القمية) في منطقة البطين الشاب (VZ) المبطنة للبطين الجانبي الخلايا العصبية الأولى ثم السلف الدبقي مع بعض الفترة المتداخلة1. يتم إنشاء الخلايا العصبية أيضا من السلف الوسيط أو الدبقية الشعاعية القاعدية في المنطقة تحت البطينية (SVZ) المجاورة ل VZ ، وكلاهما ينشأ من الدبقية الشعاعية (القمية) 2,3. في الفئران ، تنتج الخلايا الدبقية الشعاعية الخلايا العصبية فقط في اليوم الجنيني (E) 12-14 ، كل من الخلايا العصبية والأسلاف الدبقية في E15-16 ، والأسلاف الدبقية من E17 فصاعدا4. يتمايز السكان الرئيسيون من الأسلاف الدبقية المتولدة خلال هذه المراحل الجنينية بشكل تفضيلي إلى خلايا نجمية ، على الرغم من أن بعض الخلايا تتمايز أيضا إلى خلايا قليلة التغصن5. تهاجر الخلايا العصبية وأسلاف الخلايا النجمية المتولدة في هذه المراحل نحو سطح الدماغ وتدخل الصفيحة القشرية (المادة الرمادية القشرية المستقبلية). تحدث الهجرة العصبية من VZ إلى الصفيحة القشرية على مراحل متعددة. تتبنى الخلايا العصبية أولا مورفولوجيا متعددة الأقطاب فوق منطقة تراكم الخلايا متعددة الأقطاب (MAZ) ، متداخلة مع SVZ أو المنطقة الوسيطة ، حيث تمتد بقوة وتتراجع عن عمليات رقيقة متعددة وتهاجر ببطء (الهجرة متعددة الأقطاب)6,7. بعد حوالي 24 ساعة ، تتحول الخلايا العصبية إلى مورفولوجيا ثنائية القطب ، وتمتد عملية رائدة سميكة نحو سطح الدماغ وعملية لاحقة رقيقة للخلف ، وتهاجر خطيا نحو سطح الدماغ باستخدام عملية شعاعية تمتد من الدبقية الشعاعية إلى سطح بيال كسقالة ، والتي تسمى وضع الحركة 2,8. نظرا لأن الخلايا العصبية في وضع الحركة تصل دائما إلى السطح الخارجي للصفيحة القشرية ، وتمر عبر سابقاتها أسفل المنطقة الهامشية مباشرة ، يتم محاذاة الخلايا العصبية بطريقة تعتمد على تاريخ الميلاد من الداخل إلى الخارج في اللوحة القشرية9،10،11.
في المقابل ، تهاجر أسلاف الخلايا النجمية بسرعة إلى المنطقة الوسيطة والصفيحة القشرية ، مع تغييرات اتجاهية متكررة. يختلف سلوك الهجرة هذا تماما عن الهجرة العصبية ويسمى الهجرة غير المنتظمة5. تهاجر أسلاف الخلايا النجمية أيضا على طول الأوعية الدموية في عملية تسمى الهجرة الموجهة بالأوعية الدموية. تقوم أسلاف الخلايا النجمية بالتبديل بين أوضاع الهجرة هذه والوصول إلى اللوحة القشرية 5,12. على الرغم من أن موضع الخلايا النجمية لا يتم تحديده بدقة من خلال تاريخ إنتاجها ، فقد لوحظ ميل معتدل للخلايا النجمية المولودة مبكرا للاستقرار في الجزء السطحي من الصفيحة القشرية5. ومن المثير للاهتمام ، أن الخلايا النجمية التي تستقر في الصفيحة القشرية تتولد في المراحل الجنينية وتتمايز في النهاية إلى خلايا نجمية بروتوبلازمية ، في حين أن الخلايا النجمية المتولدة بعد الولادة لا تهاجر بنشاط ، وتبقى في المادة البيضاء ، وتتمايز إلى خلايا نجمية ليفية5. كيف تحدث هذه المواصفات المعتمدة على المرحلة للأنواع الفرعية النجمية لا تزال غير واضحة.
تم تحديد عدد متزايد من الجينات المشاركة في هجرة الخلايا العصبية ، بما في ذلك تلك المشاركة في اضطرابات النمو العصبي والنفسية13،14. لذلك ، من الأهمية بمكان توضيح آثار الطفرات في هذه الجينات على سلوك الخلايا العصبية المهاجرة. كما ذكرنا سابقا ، تحدث الهجرة العصبية على مراحل متعددة. يمكن أن تحدد ملاحظات الفاصل الزمني بشكل مباشر المرحلة التي تتأثر بشكل رئيسي (خروج دورة الخلية ، والانتقال متعدد الأقطاب ثنائي القطب ، وسرعة هجرة الحركة ، وما إلى ذلك). ومع ذلك ، فإن الآليات الجزيئية الكامنة وراء مواصفات الخلايا النجمية وهجرتها وموقعها لا تزال غير معروفة إلى حد كبير. بالنظر إلى أن الخلايا النجمية تلعب أدوارا حاسمة في تكوين المشبك15 وتشكيل حاجز الدم في الدماغ أثناء نمو الدماغ16 ، فقد تؤدي العيوب التنموية في الخلايا النجمية إلى اضطرابات النمو العصبي. قد توضح دراسات الفاصل الزمني على أسلاف الخلايا النجمية هذه الآليات الجزيئية وعلاقتها بالمرض العقلي.
يوفر هذا البروتوكول طريقة لمراقبة الفاصل الزمني للخلايا المشتقة من VZ القشرية. تم بالفعل نشر بروتوكول فيديو مماثل لمراقبة هجرة الخلايا العصبية17. نصف هنا طريقة كل من الخلايا العصبية المهاجرة وأسلاف الخلايا النجمية. لتسمية هذه الخلايا ببروتينات الفلورسنت ، مثل البروتينات الفلورية الخضراء والحمراء (GFP و RFP) ، يتم إدخال مخاليط البلازميد التي تحتوي على مكونات مناسبة في VZ القشري عن طريق التثقيب الكهربائي في الرحم في المراحل المناسبة18،19،20،21. تتم إزالة الأجنة التي تم التلاعب بها في المراحل المطلوبة ، ويتم تقطيع الأدمغة واستخدامها لمراقبة الفاصل الزمني باستخدام مجهر المسح بالليزر. يمكن فحص سرعة الهجرة واتجاهها والسلوكيات الأخرى ، التي لا يتم تناولها أبدا باستخدام عينات الدماغ الثابتة ، باستخدام هذه الطريقة. يمكن بسهولة نقل نواقل التثقيب الكهربائي في الرحم والتعبير والضربة القاضية / الضربة القاضية بالتزامن مع ناقلات البروتين الفلورية ، مما يمكننا من إجراء دراسات كسب الوظيفة وفقدان الوظيفة لجينات معينة.
Protocol
Representative Results
Discussion
قدم هذا البروتوكول طريقة لمراقبة الفاصل الزمني للخلايا المشتقة من VZ الشاحب (القشري). لتسمية الخلايا المهاجرة من VZ ، استخدمنا في التثقيب الكهربائي للرحم ، حيث تم تمييز الخلايا الفردية بوضوح بنسبة إشارة إلى ضوضاء أعلى من الملصقات بوساطة النواقل الفيروسية. باستخدام التثقيب الكهربائي…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
مروج Tα1 هو هدية من P. Barker و F.D. ميلر. مروج Dcx هو هدية من Q. Lu. كان hGFAP-Cre هدية من ألبي ميسينج. تم توفير نظام ناقل PiggyBac transposon من قبل معهد سانجر. تم توفير الفئران Flt1-DsRed بواسطة M. Ema (جامعة شيغا). تم دعم هذا العمل من قبل JSPS KAKENHI (رقم المنحة JP21K07309 إلى H. Tabata ، JP20H05688 و JP22K19365 إلى K. Nakajima) ومؤسسة Takeda للعلوم ، صندوق Keio Gijuku Fukuzawa التذكاري للنهوض بالتعليم والبحث ، صناديق Keio Gijuku للتطوير الأكاديمي إلى K. Nakajima.
Materials
| Aspirator tube assembly | Drummond | 2-040-000 | |
| Atipamezole (5 mg/mL) | Meiji | Mepatia | |
| Autoclip | Becton Dickinson | 427630 | 9 mm |
| B27 supplement | Gibco | 17504-044 | |
| Butorphanol (5 mg/mL) | Meiji | Vetorphale | |
| Cell culture insert | Millipore | PICM ORG 50 | |
| Confocal microscope | Nikon | A1RHD25 | Equipped with a long working distance lens (S Plan Fluor ELWD 20XC) |
| Cryomold | Tissue-Tek | 4566 | |
| Culture chamber | Tokken | TK-NBCMP | Custom-made |
| Electroporator | NEPA Gene | NEPA21 | |
| Fast Green | Sigma-Aldrich | F7258 | |
| Gas mixer | Tokken | TK-MIGM01-02 | |
| Glass base dish | Iwaki | 3910-035 | Diameter of glass base is 27 mm |
| Glass capillaries | Narishige | GD-1 | |
| HBS (2x) | Sigma-Aldrich | 51558 | |
| HBSS(-) | Wako | 084-08345 | |
| Heater Unit | Tokken | TK-0003HU20 | Custom-made, including hood and heater |
| hGFAP-Cre | Addgene | #40591 | A gift from Albee Messing |
| ImageJ | https://imagej.net/ij/ | ||
| L-glutamine (200 mM) | Gibco | 25030 | |
| Low melting temperature agarose | Lonza | 50100 | |
| Medetomidine (1 mg/mL) | Meiji | Medetomin | |
| Microinjector | Narishige | IM-300 | |
| Midazolam (5 mg/mL) | Sandoz | Midazolam | |
| MTrackJ | https://imagescience.org/meijering/software/mtrackj/ | ||
| Neurobasal medium | Gibco | 21103-049 | |
| pCAG-hyPBase | The hyPBase cDNA from pCMV-hyPBase (a gift from Sanger Institute) was inserted into the downstream of the CAG promoter of pCAGGS (a gift from J. Miyazaki). | ||
| pDcx-Dre | The Dcx promoter from Dcx4kbEGFP70 (a gift from Q. Lu) was exchanged with CAG promoter of pCAG-NLS-HA-Dre34 (a gift from Pawel Pelczar, Addgene #51272). | ||
| Penicillin + Streptomycin | Gibco | 15140122 | |
| Plasmid purification kit | Invitrogen | PureLink HiPure plasmid midiprep kit (K210005) | |
| pPB-CAG-LNL-RFP | CAG-LNL cassette from pCALNL-DsRed (a gift from Connie Cepko, Addgene #13769), and TurboRFP cDNA (Evrogen, FP232) were inserted into the cloning site of pPB-CAG.EBNXN (a gift from Sanger Institute). | ||
| pPB-CAG-rDIO-EGFP | The sequence containning synthetic rox sites, synthetic DIO cassette, and EGFP cDNA from pEGFP-N1 (Clontech, U55762) in reverse direction were inserted into the cloning site of pPB-CAG.EBNXN (a gift from Sanger Institute). The sequence is provided in the Supplementary File. | ||
| Puller | Narishige | PN-31 | |
| StackRed | a plugin for ImageJ | http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/stackreg/ | |
| Suture needle | Nazme | C-24-521-R No.1 | 1/2 circle, length 14 mm |
| Suture thread | Nazme | C-23-B2 | Silk, size 5-0 |
| Timed pregnant ICR (wild-type) mice | Japan SLC | ICR mouse | |
| TrackMate | https://imagej.net/plugins/trackmate/index | ||
| Tweezer-type electrode | BEX or NEPA Gene | CUY650P5 | |
| Tα1-EGFP | EGFP cDNA from pEGFP-N1 (Clontech, U55762) was inserted into the downstream of the Tα1 promoter in plasmid 253 (a gift from P. Barker and F.D.Miller) | ||
| Vibrating microtome | Leica or Zeiss | Vibrating blade microtome VT1000S or Hyrax V50. |
References
- Kriegstein, A., Alvarez-Buylla, A. The glial nature of embryonic and adult neural stem cells. Annu Rev Neurosci. 32 (1), 149-184 (2009).
- Noctor, S. C., Martínez-Cerdeño, V., Ivic, L., Kriegstein, A. R. Cortical neurons arise in symmetric and asymmetric division zones and migrate through specific phases. Nat Neurosci. 7 (2), 136-144 (2004).
- Haubensak, W., Attardo, A., Denk, W., Huttner, W. B. Neurons arise in the basal neuroepithelium of the early mammalian telencephalon: A major site of neurogenesis. P Natl Acad Sci USA. 101 (9), 3196-3201 (2004).
- Yoshida, A., Yamaguchi, Y., Nonomura, K., Kawakami, K., Takahashi, Y., Miura, M. Simultaneous expression of different transgenes in neurons and glia by combining in utero electroporation with the Tol2 transposon-mediated gene transfer system. Genes Cells. 15 (5), 501-512 (2010).
- Tabata, H., et al. Erratic and blood vessel-guided migration of astrocyte progenitors in the cerebral cortex. Nat Commun. 13 (1), 6571 (2022).
- Tabata, H., Nakajima, K. Multipolar Migration: The third mode of radial neuronal migration in the developing cerebral cortex. J Neurosci. 23 (31), 9996-10001 (2003).
- Tabata, H., Kanatani, S., Nakajima, K. Differences of migratory behavior between direct progeny of apical progenitors and basal progenitors in the developing cerebral cortex. Cereb Cortex. 19 (9), 2092-2105 (2009).
- Rakic, P. Mode of cell migration to the superficial layers of fetal monkey neocortex. J Comp Neurol. 145 (1), 61-83 (1972).
- Sekine, K., Honda, T., Kawauchi, T., Kubo, K., Nakajima, K. The outermost region of the developing cortical plate is crucial for both the switch of the radial migration mode and the Dab1-dependent "inside-out" lamination in the neocortex. J Neurosci. 31 (25), 9426-9439 (2011).
- Shin, M., et al. Both excitatory and inhibitory neurons transiently form clusters at the outermost region of the developing mammalian cerebral neocortex. J Comp Neurol. 527 (10), 1577-1597 (2019).
- Sekine, K., et al. Reelin controls neuronal positioning by promoting cell-matrix adhesion via inside-out activation of integrin α5β1. Neuron. 76 (2), 353-369 (2012).
- Morimoto, K., Tabata, H., Takahashi, R., Nakajima, K. Interactions between neural cells and blood vessels in central nervous system development. BioEssays. 230091, (2023).
- Tabata, H., Nagata, K. Decoding the molecular mechanisms of neuronal migration using in utero electroporation. Med Mol Morphol. 49 (2), 63-75 (2016).
- Ishii, K., Kubo, K., Nakajima, K. Reelin and neuropsychiatric disorders. Front Cell Neurosci. 10, 229 (2016).
- Bosworth, A. P., Allen, N. J. The diverse actions of astrocytes during synaptic development. Curr Opin Neurobiol. 47, 38-43 (2017).
- Tabata, H. Crosstalk between blood vessels and glia during the central nervous system development. Life. 12 (11), 1761 (2022).
- Wiegreffe, C., Feldmann, S., Gaessler, S., Britsch, S. Time-lapse confocal imaging of migrating neurons in organotypic slice culture of embryonic mouse brain using in utero electroporation. J Vis Exp. (125), e55886 (2017).
- Saito, T., Nakatsuji, N. Efficient Gene Transfer into the Embryonic Mouse Brain Using in Vivo Electroporation. Dev Biol. 240 (1), 237-246 (2001).
- Tabata, H., Nakajima, K. Labeling embryonic mouse central nervous system cells by in utero electroporation. Dev Growth Differ. 50 (6), 507-511 (2008).
- Tabata, H., Nakajima, K. Efficient in utero gene transfer system to the developing mouse brain using electroporation: visualization of neuronal migration in the developing cortex. Neuroscience. 103 (4), 865-872 (2001).
- Fukuchi-Shimogori, T. Neocortex patterning by the secreted signaling molecule FGF8. Science. 294 (5544), 1071-1074 (2001).
- Matsumoto, K., et al. Study of normal and pathological blood vessel morphogenesis in Flt1-tdsRed BAC Tg mice. Genesis. 50 (7), 561-571 (2012).
- Kawai, S., Takagi, Y., Kaneko, S., Kurosawa, T. Effect of three types of mixed anesthetic agents alternate to ketamine in mice. Exp Anim. 60 (5), 481-487 (2011).
- Meijering, E., Dzyubachyk, O., Smal, I. Methods for cell and particle tracking. Methods Enzymol. 504, 183-200 (2012).
- Ershov, D., et al. TrackMate 7: Integrating state-of-the-art segmentation algorithms into tracking pipelines. Nat Methods. 19 (7), 829-832 (2022).
- Tinevez, J. -. Y., et al. TrackMate: An open and extensible platform for single-particle tracking. Methods. 115, 80-90 (2017).
- Gloster, A., et al. The T alpha 1 alpha-tubulin promoter specifies gene expression as a function of neuronal growth and regeneration in transgenic mice. J Neurosci. 14 (12), 7319-7330 (1994).
- Zhuo, L., et al. hGFAP-cre transgenic mice for manipulation of glial and neuronal function in vivo. Genesis. 31 (2), 85-94 (2001).
- Yusa, K., Zhou, L., Li, M. A., Bradley, A., Craig, N. L. A hyperactive piggyBac transposase for mammalian applications. P Natl Acad Sci USA. 108 (4), 1531-1536 (2011).
- Chen, F., LoTurco, J. A method for stable transgenesis of radial glia lineage in rat neocortex by piggyBac mediated transposition. J Neurosci Meth. 207 (2), 172-180 (2012).
- Wang, X., Qiu, R., Tsark, W., Lu, Q. Rapid promoter analysis in developing mouse brain and genetic labeling of young neurons by doublecortin-DsRed-express. J Neurosci Res. 85 (16), 3567-3573 (2007).
- Sauer, B. DNA recombination with a heterospecific Cre homolog identified from comparison of the pac-c1 regions of P1-related phages. Nucleic Acids Res. 32 (20), 6086-6095 (2004).
- Hermann, M., et al. Binary recombinase systems for high-resolution conditional mutagenesis. Nucleic Acids Res. 42 (6), 3894-3907 (2014).
- Kanatani, S., et al. The COUP-TFII/Neuropilin-2 is a molecular switch steering diencephalon-derived GABAergic neurons in the developing mouse brain. P Natl Acad Sci USA. 112 (36), E4985-E4994 (2015).
- Yozu, M., Tabata, H., Nakajima, K. The caudal migratory stream: A novel migratory stream of interneurons derived from the caudal ganglionic eminence in the developing mouse forebrain. J Neurosci. 25 (31), 7268-7277 (2005).
- Kanatani, S., Yozu, M., Tabata, H., Nakajima, K. COUP-TFII is preferentially expressed in the caudal ganglionic eminence and is involved in the caudal migratory stream. J Neurosci. 28 (50), 13582-13591 (2008).
- Kitazawa, A., et al. Hippocampal pyramidal neurons switch from a multipolar migration mode to a novel "climbing" migration mode during development. J Neurosci. 34 (4), 1115-1126 (2014).
