Характеристика модуляторов рецепторов, активируемых протеазой, с помощью анализа мобилизации кальция с использованием планшетного ридера

Рецепторы, активируемые протеазой (PAR)^1,2,3 представляют собой подсемейство рецепторов, сопряженных с белком G класса А (GPCR), которые экспрессируются в различных типах клеток, включая тромбоциты и эндотелиальные клетки ^4,5,6,7. В отличие от большинства GPCR, PAR обладают уникальным внутримолекулярным режимом активации. Большинство GPCR активируются растворимыми лигандами, взаимодействующими с отчетливым связывающим карманом, но PARs активируются протеолитическим расщеплением N-конца, что приводит к образованию нового связанного лиганда, который может взаимодействовать с доменом внеклеточной петли 2 на поверхности клетки ^6,8,9. Это взаимодействие активирует рецептор и может инициировать несколько сигнальных путей, способствуя таким эффектам, как воспаление и активация тромбоцитов 4,10,11,12. Различные протеазы могут активировать PARs путем расщепления в уникальных участках на N-конце, выявляя различные привязанные лиганды (TL), которые стабилизируют конформации рецепторов, инициирующие различные сигнальные пути 9,13,14,15. Например, у наиболее хорошо изученного члена подсемейства, PAR1, расщепление тромбином используется для поддержки многочисленных биологических процессов, включая активацию тромбоцитов и рекрутирование лейкоцитов в эндотелий, но может приводить к вредным эффектам при гиперэкспрессии или гиперактивации рецептора 4,16,17,18,19,20,21 . И наоборот, расщепление активированным протеином С (aPC) может способствовать противовоспалительному эффекту и поддержанию эндотелиальных барьеров 15,22,23,24,25,26,27,28,29. PARs также могут быть активированы пептидными аналогами TLs межмолекулярным образом 13,30,31. Эти пептиды обычно используются для измерения ингибирования (модуляции) PAR вместо протеаз, нацеленных на PAR, и они используются в данном протоколе.

С патологической передачей сигналов PAR1 связаны многочисленные расстройства, в том числе сепсис^22,32, сердечно-сосудистые заболевания 33,34,35,36,37,38, заболевания почек 39,40,41,42, серповидноклеточная анемия ⁴³, фиброз⁴⁴, остеопороз и остеоартрит^45,46, нейродегенерация 47,48,49,50,51 и рак 52,53,54,55,56,57,58,59. Антагонисты PAR1 изучаются с 1990-х годов в качестве антитромбоцитарных препаратов для лечения сердечно-сосудистых заболеваний, и растущий список заболеваний, связанных с рецептором, требует идентификации новых лигандов для использования в качестве биологических зондов (инструментальных соединений) или в качестве потенциальных терапевтических средств. В настоящее время существует только один одобренный FDA антагонист PAR1, ворапаксар, который используется для лечения ишемической болезни сердца у пациентов с высоким риском 34,36,37,60. Альтернативный антагонист PAR1, пепдуцин PZ-128, завершил успешное исследование II фазы по предотвращению тромбоза^{у пациентов с} катетеризацией сердца. Группа Докендорфа сосредоточилась на медицинской химии и фармакологии отдельного класса малых молекул, лигандов PAR1, известных как пармодулины^61,62. В отличие от зарегистрированных антагонистов PAR1, таких как ворапаксар, пармодулины являются аллостерическими, смещенными модуляторами PAR1, которые избирательно блокируют путь G_αq, способствуя цитопротекторным эффектам, подобным aPC. В отличие от мощных ортостерических антагонистов PAR1, таких как ворапаксар, опубликованные пармодулины также являются обратимыми 63,64,65.

Первоначально пармодулины были идентифицированы Флауменхафтом и его коллегами по их способности ингибировать экспрессию Р-селектина или секрецию гранул в тромбоцитах^61,66. Тем не менее, потребовался альтернативный метод для изучения влияния пармодулинов на эндотелиальные клетки. Одним из распространенных методов мониторинга сигнализации, связанной с GPCR, является измерение внутриклеточной мобилизации^Ca2+, важного вторичного посредника, который может быть измерен с помощью подходящего внутриклеточного кальцийсвязывающего красителя^67,68. Были предоставлены существенные доказательства, показывающие, что мобилизация кальция, индуцированная PAR1, происходит за счет активации G_αq ^69,70. После активации привязанным лигандом (или подходящим экзогенным лигандом) PAR1 претерпевает конформационное изменение, в результате которого гуанозиндифосфат (GDP), связанный с субъединицей G_αq, заменяется гуанозинтрифосфатом (ГТФ)⁶⁸. Затем субъединица G_αq активирует фосфолипазу Cβ (PLC-β), которая катализирует гидролиз фосфатидилинозитол 4,5 бисфосфата (PIP2), образуя 1,4,5-инозитолтрифосфат (IP₃) и диацилглицерин (DAG). Наконец, IP₃ связывается с IP_{3-чувствительными} каналами^Ca2+ в мембране эндоплазматического ретикулума, позволяя Ca²⁺ высвобождаться в цитоплазму, где он может связываться с Ca2⁺-зависимыми флуоресцентными красителями, такими как Fluo-4, которые добавляются к клеткам⁷¹. Этот процесс происходит в течение нескольких секунд и может увеличить концентрацию Ca²⁺ в 100 раз, что приводит к резкому изменению количества связанного с кальцием красителя и сильного флуоресцентного сигнала.

В 2018 году группа Докендорфа раскрыла анализ мобилизации Ca²⁺ со средней пропускной способностью, который может быть использован для идентификации антагонистов пути G_αq PAR1⁷². В анализе использовалась EA.hy926⁷³, гибридная линия эндотелиальных клеток человека, которая может быть использована для множественных пассажей без заметного изменения экспрессии PAR1 и предназначена для измерений цитопротекторных эффектов in vitro .

В оригинальном протоколе использовались ячейки EA.hy926 в 96-луночных планшетах и с добавлением красителя Fluo-4/AM, который был выбран из-за его интенсивной флуоресценции на длине волны 488 нм и высокой проницаемости клеток. После загрузки красителя в ячейки выполнялись длительные этапы промывки с помощью автоматизированного 8-канального обработчика жидкости (более быстрые методы обработки жидкости, такие как 96-канальная промывка, были недоступны). Воспроизводимость этого анализа была лучше, чем без тщательной автоматизированной смены среды. Затем антагонисты инкубировали с клетками, PAR1 активировали путем последовательного добавления селективного агониста (16 лунок за раз), а для определения активности измеряли изменения флуоресценции, возникающие в результате мобилизации кальция и связывания красителя.

Хотя этот протокол позволяет измерить PAR1-опосредованную мобилизацию кальция, он ограничен временем, необходимым для анализа каждого 96-луночного планшета. Длительное время экспериментов проблематично не только потому, что количество соединений, которые можно проверять каждый день, ограничено, но и потому, что отток красителя происходит с течением времени, сужая окно анализа за счет увеличения базальной флуоресценции. Одним из факторов, способствующих длительному времени эксперимента, является использование 8-канального манипулятора жидкости для мытья тарелок, что добавляет более 30 минут к каждому эксперименту. Необходимые чаевые также стало трудно получить из-за проблем с цепочкой поставок. Здесь представлен обновленный протокол PAR-опосредованного анализа мобилизации кальция, который не требует работы с жидкостью и, следовательно, может выполняться с более высокой пропускной способностью. Этот протокол также должен быть пригоден для измерения передачи сигналов с другими GPCR, которые приводят к внутриклеточной мобилизации кальция. Этот обновленный протокол считывания планшетов идеально подходит для академических и небольших промышленных лабораторий, которые не располагают ресурсами для дорогостоящих приборов для визуализации клеток, но нуждаются в быстром скрининге многочисленных соединений. Пример анализа мобилизации кальция с использованием планшетного тепловизора см. Caers et ^al.74.