Caracterização de moduladores de receptores ativados por protease com um ensaio de mobilização de cálcio usando um leitor de placas

Os receptores ativados por protease (PARs)^1,2,3 são uma subfamília de receptores acoplados à proteína G classe A (GPCRs) que são expressos em uma variedade de tipos de células, incluindo plaquetas e células endoteliais ^4,5,6,7. Ao contrário da maioria dos GPCRs, os PARs têm um modo intramolecular único de ativação. A maioria dos GPCRs é ativada por ligantes solúveis interagindo com uma bolsa de ligação distinta, mas os PARs são ativados pela clivagem proteolítica do terminal N, o que resulta em um novo ligante amarrado que pode interagir com o domínio da alça extracelular 2 na superfície de uma célula ^6,8,9. Essa interação ativa o receptor e pode iniciar várias vias de sinalização, promovendo efeitos como inflamação e ativação plaquetária 4,10,11,12. Diferentes proteases podem ativar PARs por meio de clivagem em locais únicos no terminal N, revelando diferentes ligantes amarrados (TL) que estabilizam as conformações do receptor, que iniciam diferentes vias de sinalização 9,13,14,15. Por exemplo, no membro mais bem estudado da subfamília, PAR1, a clivagem pela trombina é usada para apoiar vários processos biológicos, incluindo ativação plaquetária e recrutamento de leucócitos para o endotélio, mas pode levar a efeitos deletérios quando o receptor é superexpresso ou superativado 4,16,17,18,19,20,21 . Por outro lado, a clivagem pela proteína C ativada (aPC) pode promover efeitos anti-inflamatórios e manutenção das barreiras endoteliais 15,22,23,24,25,26,27,28,29. Os PARs também podem ser ativados por análogos peptídicos dos TLs de forma intermolecular 13,30,31. Esses peptídeos são rotineiramente usados para medir a inibição (modulação) de PAR no lugar de proteases direcionadas a PAR, e são usados neste protocolo.

Numerosos distúrbios estão associados à sinalização patológica de PAR1, incluindo sepse^22,32, doença cardiovascular 33,34,35,36,37,38, doença renal 39,40,41,42, doença falciforme⁴³, fibrose ⁴⁴, osteoporose e osteoartrite^45,46, neurodegeneração 47,48,49,50,51 e câncer 52,53,54,55,56,57,58,59. Os antagonistas do PAR1 têm sido estudados desde a década de 1990 como agentes antiplaquetários para doenças cardiovasculares, e a crescente lista de doenças associadas ao receptor requer a identificação de novos ligantes para uso como sondas biológicas (compostos de ferramentas) ou como potenciais terapêuticos. Atualmente, existe apenas um antagonista PAR1 aprovado pela FDA, o vorapaxar, que é usado para tratar a doença arterial coronariana em pacientes de alto risco 34,36,37,60. Um antagonista alternativo de PAR1, a pepducina PZ-128, completou um estudo de fase II bem-sucedido para prevenir trombose em pacientes com cateterismo cardíaco³⁸. O grupo de Dockendorff concentrou-se na química medicinal e farmacologia de uma classe separada de pequenas moléculas, ligantes PAR1 conhecidos como parmodulinas ^61,62. Ao contrário dos antagonistas de PAR1 relatados, como o vorapaxar, as parmodulinas são moduladores alostéricos e tendenciosos de PAR1 que bloqueiam seletivamente a via G_αq enquanto promovem efeitos citoprotetores semelhantes ao aPC. Ao contrário dos potentes antagonistas ortostéricos de PAR1, como o vorapaxar, as parmodulinas publicadas também são reversíveis 63,64,65.

Inicialmente, as parmodulinas foram identificadas por Flaumenhaft e colaboradores por sua capacidade de inibir a expressão da P-selectina ou a secreção de grânulos nas plaquetas^61,66. No entanto, um método alternativo foi necessário para estudar os efeitos das parmodulinas nas células endoteliais. Um método comum para monitorar a sinalização relacionada ao GPCR é medir a mobilização intracelular de Ca²⁺, um importante mensageiro secundário que pode ser medido usando um corante de ligação de cálcio intracelular adequado^67,68. Evidências substanciais foram fornecidas mostrando que a mobilização de cálcio induzida por PAR1 é através da ativação de G_αq^69,70. Uma vez ativado por seu ligante ligado (ou um ligante exógeno adequado), o PAR1 sofre uma mudança conformacional que faz com que o difosfato de guanosina (GDP) ligado à subunidade G_αq seja substituído por trifosfato de guanosina (GTP) ⁶⁸ . A subunidade G_αq então ativa a fosfolipase Cβ (PLC-β), que catalisa a hidrólise do fosfatidilinositol 4,5 bifosfato (PIP2), formando trifosfato de 1,4,5-inositol (IP₃) e diacilglicerol (DAG). Finalmente, o IP₃ se liga aos canais de Ca²⁺ sensíveis ao IP₃ na membrana do retículo endoplasmático, permitindo que o Ca²⁺ seja liberado no citoplasma, onde pode se ligar a corantes fluorescentes dependentes de Ca²⁺, como o Fluo-4, que são adicionados às células⁷¹. Esse processo ocorre em segundos e pode aumentar a concentração de Ca²⁺ em 100 vezes, levando a uma mudança drástica na quantidade de corante ligado ao cálcio e a um sinal de fluorescência robusto.

Em 2018, o grupo de Dockendorff divulgou um ensaio de mobilização de Ca²⁺ de médio rendimento que poderia ser usado para identificar antagonistas da via G_αq de PAR1⁷². O ensaio utilizou EA.hy926⁷³, uma linhagem de células endoteliais humanas híbridas, que pode ser usada para múltiplas passagens sem uma alteração perceptível na expressão de PAR1, e é estabelecida para medições in vitro de efeitos citoprotetores.

O protocolo original utilizava células EA.hy926 em placas de 96 poços e carregadas com corante Fluo-4/AM, que foi escolhido devido à sua intensa fluorescência a 488 nm e alta permeabilidade celular. Uma vez que o corante foi carregado nas células, longas etapas de lavagem foram realizadas com um manipulador de líquido automatizado de 8 canais (métodos mais rápidos de manuseio de líquidos, como uma lavadora de 96 canais, eram inacessíveis). A reprodutibilidade deste ensaio foi superior àquela sem as mudanças cuidadosas e automatizadas de meios robóticos. Os antagonistas foram então incubados com as células, o PAR1 foi ativado através da adição sequencial de um agonista seletivo (16 poços por vez) e as alterações na fluorescência resultantes da mobilização de cálcio e ligação do corante foram medidas para determinar a atividade.

Embora este protocolo permita a medição da mobilização de cálcio mediada por PAR1, ele é limitado pelo tempo necessário para analisar cada placa de 96 poços. Longos tempos de experimento são problemáticos não apenas porque o número de compostos que podem ser rastreados a cada dia é limitado, mas também porque o efluxo de corante ocorre ao longo do tempo, estreitando a janela de ensaio aumentando a fluorescência basal. Um contribuinte para o longo tempo do experimento é o uso de um manipulador de líquidos de 8 canais para lavagem de chapas, que adiciona mais de 30 minutos a cada experimento. As dicas necessárias também se tornaram difíceis de obter devido a problemas na cadeia de suprimentos. Aqui, é relatado um protocolo atualizado para o ensaio de mobilização de cálcio mediado por PAR que não requer um manipulador de líquido e, portanto, pode ser executado em maior rendimento. Este protocolo também deve ser adequado para medir a sinalização com outros GPCRs que levam à mobilização intracelular de cálcio. Este protocolo de leitor de placas atualizado é ideal para laboratórios acadêmicos e industriais pequenos que não têm recursos para instrumentos caros de imagem celular, mas precisam rastrear rapidamente vários compostos. Para um exemplo de um ensaio de mobilização de cálcio usando um imageador de placas, ver Caers et ^al.74.