Se ha desarrollado un protocolo mejorado para un ensayo de movilización de calcio con células endoteliales, utilizado para identificar ligandos de receptores activados por proteasas (PAR). El nuevo protocolo reduce el tiempo total de ensayo entre 90 y 120 minutos y produce curvas de concentración-respuesta reproducibles.
Los cambios en la concentración de calcio en las células se monitorean rápidamente de una manera de alto rendimiento con el uso de tintes intracelulares, fluorescentes que se unen al calcio e instrumentos de imagen que pueden medir las emisiones fluorescentes de hasta 1.536 pocillos simultáneamente. Sin embargo, estos instrumentos son mucho más caros y pueden ser difíciles de mantener en comparación con los lectores de placas ampliamente disponibles que escanean los pocillos individualmente. Aquí se describe un ensayo de lector de placas optimizado para su uso con una línea celular endotelial (EA.hy926) para medir la activación impulsada por el receptor activado por proteasa (PAR) de la señalización Gαq y la posterior movilización de calcio utilizando el colorante de unión al calcio Fluo-4. Este ensayo se ha utilizado para caracterizar una variedad de ligandos PAR, incluidos los ligandos antiinflamatorios “parmodulina” alostéricos dirigidos a PAR1 identificados en el laboratorio de Dockendorff. Este protocolo evita la necesidad de un manipulador de líquidos automatizado y permite el cribado de ligandos PAR en placas de 96 pocillos y debería ser aplicable al estudio de otros receptores que inician la movilización del calcio.
Los receptores activados por proteasas (PAR)1,2,3 son una subfamilia de receptores acoplados a proteínas G (GPCR) de clase A que se expresan en una variedad de tipos de células, incluidas las plaquetas y las células endoteliales 4,5,6,7. A diferencia de la mayoría de los GPCR, los PAR tienen un modo de activación intramolecular único. La mayoría de los GPCR son activados por ligandos solubles que interactúan con un bolsillo de unión distinto, pero los PAR son activados por la escisión proteolítica del N-terminal, lo que da como resultado un nuevo ligando atado que puede interactuar con el dominio del bucle extracelular 2 en la superficie de una célula 6,8,9. Esta interacción activa el receptor y puede iniciar varias vías de señalización, promoviendo efectos como la inflamación y la activación plaquetaria 4,10,11,12. Diferentes proteasas pueden activar PARs a través de la escisión en sitios únicos en el extremo N-terminal, revelando diferentes ligandos atados (TL) que estabilizan las conformaciones de los receptores, que inician diferentes vías de señalización 9,13,14,15. Por ejemplo, en el miembro más estudiado de la subfamilia, PAR1, la escisión por trombina se utiliza para apoyar numerosos procesos biológicos, incluida la activación plaquetaria y el reclutamiento de leucocitos al endotelio, pero puede provocar efectos deletéreos cuando el receptor se sobreexpresa o se sobreactiva 4,16,17,18,19,20,21 . Por el contrario, la escisión por la proteína C activada (aPC) puede promover efectos antiinflamatorios y mantenimiento de las barreras endoteliales 15,22,23,24,25,26,27,28,29. Los PARs también pueden ser activados por análogos peptídicos de los TLs de forma intermolecular 13,30,31. Estos péptidos se utilizan de forma rutinaria para medir la inhibición (modulación) de PAR en lugar de las proteasas dirigidas a PAR, y se utilizan en este protocolo.
Numerosos trastornos se asocian con la señalización patológica de PAR1, incluyendo sepsis22,32, enfermedad cardiovascular 33,34,35,36,37,38, enfermedad renal 39,40,41,42, enfermedad de células falciformes43, fibrosis44, osteoporosis y osteoartritis45,46, neurodegeneración 47,48,49,50,51 y cáncer 52,53,54,55,56,57,58,59. Los antagonistas de PAR1 se han estudiado desde la década de 1990 como agentes antiplaquetarios para las enfermedades cardiovasculares, y la creciente lista de enfermedades asociadas con el receptor requiere la identificación de nuevos ligandos para su uso como sondas biológicas (compuestos herramienta) o como posibles terapias. Actualmente, solo existe un antagonista de PAR1 aprobado por la FDA, vorapaxar, que se usa para tratar la enfermedad de las arterias coronarias en pacientes de alto riesgo 34,36,37,60. Un antagonista alternativo de PAR1, la pepducina PZ-128, completó con éxito un estudio de fase II para prevenir la trombosis en pacientes con cateterismo cardíaco38. El grupo de Dockendorff se ha centrado en la química medicinal y la farmacología de una clase separada de moléculas pequeñas, los ligandos PAR1 conocidos como parmodulinas 61,62. A diferencia de los antagonistas de PAR1 reportados, como el vorapaxar, las parmodulinas son moduladores alostéricos y sesgados de PAR1 que bloquean selectivamente la vía Gαq mientras promueven efectos citoprotectores similares a los de aPC. A diferencia de los potentes antagonistas ortostéricos de PAR1 como el vorapaxar, las parmodulinas publicadas también son reversibles 63,64,65.
Inicialmente, las parmodulinas fueron identificadas por Flaumenhaft y colaboradores por su capacidad para inhibir la expresión de P-selectina o la secreción de gránulos en plaquetas61,66. Sin embargo, se requería un método alternativo para estudiar los efectos de las parmodulinas en las células endoteliales. Un método común para monitorear la señalización relacionada con GPCR es medir la movilización intracelular de Ca2+, un mensajero secundario importante que se puede medir utilizando un colorante intracelular adecuado que se une al calcio67,68. Se han proporcionado pruebas sustanciales que demuestran que la movilización de calcio inducida por PAR1 se produce a través de la activación de Gαq 69,70. Una vez activado por su ligando anclado (o un ligando exógeno adecuado), PAR1 sufre un cambio conformacional que hace que el difosfato de guanosina (GDP) unido a la subunidadG αq sea reemplazado por trifosfato de guanosina (GTP)68. A continuación, la subunidadG αq activa la fosfolipasa Cβ (PLC-β), que cataliza la hidrólisis del fosfatidilinositol 4,5 bisfosfato (PIP2), formando trifosfato de 1,4,5-inositol (IP3) y diacilglicerol (DAG). Finalmente, IP3 se une a los canales de Ca2+ sensibles a IP3 en la membrana del retículo endoplásmico, lo que permite que el Ca2+ se libere en el citoplasma, donde puede unirse a colorantes fluorescentes dependientes de Ca2+, como Fluo-4, que se agregan a las células71. Este proceso ocurre en segundos y puede aumentar la concentración de Ca2+ 100 veces, lo que lleva a un cambio drástico en la cantidad de tinte unido al calcio y una señal de fluorescencia robusta.
En 2018, el grupo de Dockendorff reveló un ensayo de movilización de Ca2+ de rendimiento medio que podría usarse para identificar antagonistas de la vía Gαq de PAR172. El ensayo utilizó EA.hy92673, una línea celular endotelial humana híbrida, que se puede usar para múltiples pasajes sin un cambio notable en la expresión de PAR1, y se establece para mediciones in vitro de efectos citoprotectores.
El protocolo original utilizó células EA.hy926 en placas de 96 pocillos y cargadas con colorante Fluo-4/AM, que se eligió debido a su intensa fluorescencia a 488 nm y su alta permeabilidad celular. Una vez que el tinte se cargaba en las celdas, se realizaban largos pasos de lavado con un manipulador de líquidos automatizado de 8 canales (los métodos más rápidos de manejo de líquidos, como una lavadora de 96 canales, eran inaccesibles). La reproducibilidad de este ensayo fue superior a la que se produjo sin los cambios cuidadosos y automatizados de medios robóticos. A continuación, se incubaron antagonistas con las células, PAR1 se activó mediante la adición secuencial de un agonista selectivo (16 pocillos a la vez) y se midieron los cambios en la fluorescencia resultantes de la movilización del calcio y la unión del colorante para determinar la actividad.
Si bien este protocolo permite la medición de la movilización de calcio mediada por PAR1, está limitado por el tiempo requerido para analizar cada placa de 96 pocillos. Los largos tiempos de experimentación son problemáticos no solo porque el número de compuestos que se pueden analizar cada día es limitado, sino también porque el flujo de colorante se produce con el tiempo, lo que reduce la ventana de ensayo al aumentar la fluorescencia basal. Un factor que contribuye al largo tiempo del experimento es el uso de un manipulador de líquidos de 8 canales para el lavado de placas, que agrega más de 30 minutos a cada experimento. Las propinas requeridas también se volvieron difíciles de obtener debido a problemas en la cadena de suministro. Aquí se informa de un protocolo actualizado para el ensayo de movilización de calcio mediado por PAR que no requiere un manipulador de líquidos y, por lo tanto, puede ejecutarse con un mayor rendimiento. Este protocolo también debería ser adecuado para medir la señalización con otros GPCR que conducen a la movilización de calcio intracelular. Este protocolo de lector de placas actualizado es ideal para laboratorios académicos y pequeños laboratorios industriales que no tienen los recursos para costosos instrumentos de imágenes celulares, pero tienen la necesidad de analizar rápidamente numerosos compuestos. Para un ejemplo de un ensayo de movilización de calcio utilizando un generador de imágenes en placas, véase Caers et al.74.
Si bien el protocolo72 reportado anteriormente fue generalmente confiable y nos permitió identificar una nueva parmodulina principal, NRD-21,62, se deseaba un protocolo más eficiente. El ensayo se vio aún más comprometido durante la escasez de suministro causada por la pandemia de COVID-19. La adquisición de puntas para el manipulador automático de líquidos se volvió difícil, y el intento de lavar, esterilizar y reutilizar las punt…
The authors have nothing to disclose.
Agradecemos a Irene Hernández, Trudy Holyst, al Dr. Hartmut Weiler (Instituto de Investigación de la Sangre Versiti) y al Dr. Leggy Arnold (Universidad de Wisconsin-Milwaukee) por proporcionar espacio y apoyo indirecto a este proyecto, y al Dr. John McCorvy (Colegio Médico de Wisconsin) por los consejos pertinentes. Agradecemos al Instituto Nacional del Corazón, los Pulmones y la Sangre (R15HL127636), al Departamento de Defensa de los Estados Unidos (W81XWH22101) y a la Fundación Nacional de Ciencias (2223225) por el apoyo de las subvenciones.
Cell Culture Reagents | |||
Adherent EA.hy926 cells | ATCC | CRL-2922 | |
CellStripper cell dissociation reagent | Corning | 25-056-CI | Trypsin can optionally be used, but should definitely be avoided with PAR2 assays. |
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) w/phenol red | Corning | 10-013-CV | |
Fetal Bovine Serum (FBS) | Avantor | 97068-091 | |
Gelatin from porcine skin | MilliporeSigma | G2500 | Use to make an aqueous 0.4% (w/v) solution with deionized water. Autoclave before use to sterilize. |
Pen/Strep (100X) | Corning | 30-002-CI | |
Phosphate-buffered saline (PBS) | Corning | 21-040-CV | |
Trypan Blue (0.4% w/v) | Corning | 25-900-CI | |
Calcium Mobilization Reagents | |||
4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES) | Thermo | 172571000 | |
Bovine serum albumin (BSA) | Avantor | 97061-420 | |
Calcium chloride dihydrate | Thermo | 42352-0250 | |
Dimethyl sulfoxide | Thermo | J66650-AD | |
Fluo-4/AM | Invitrogen | F14201 | |
Hank's balanced salt solution (Ca/Mg/phenol-red free) | Corning | 21-022-CV | |
Magnesium chloride hexahydrate | MilliporeSigma | M2393 | |
Pluronic F-127 (Poloxamer 407) | Spectrum Chemical | P1166 | |
Probenecid | TCI America | P1975 | |
Sodium hydroxide | VWR International | BDH9292 | |
TFLLRN-NH2 (TFA salt) | Prepared by Trudy Holyst at the Versiti Blood Research Institute | ||
Materials | |||
96-well culture-treated, black-walled, clear bottom assay plate | Corning | 3603 | with transparent lids |
Centrifuge tube, 15 mL | Avantor | 89039-664 | |
Centrifuge tube, 50 mL | Avantor | 89039-656 | |
Culture flask, T-75 | Corning | 353136 | tissue culture treated |
Disposable reagent reservoir, 50 mL | Corning | RES-V-50-S | |
Enspire plate reader | Perkin Elmer | Discontinued | |
Microcentrifuge tube, 1.5 mL | Avantor | 20170-038 | |
Pasteur pipette, 9" | Fisher | 13-678-6B | must be sterilized |
PCR tube strip with separate flat cap strips | Avantor | 76318-802 | |
Pipette tips, 20 µL | Biotix | 63300042 | sterile, filtered tips |
Pipette tips, 200 µL | Biotix | 63300044 | sterile, filtered tips |
Pipette tips, 1250 µL | Biotix | 63300047 | sterile, filtered tips |
Prism | GraphPad | volume 6 used | |
Serological pipette, 5 mL | Tradewinds Direct | 07-5005 | |
Serological pipette, 10 mL | Tradewinds Direct | 07-5010 | |
Serological pipette, 25 mL | Tradewinds Direct | 07-5025 |