Charakterisierung von Modulatoren von Protease-aktivierten Rezeptoren mit einem Calciummobilisierungsassay unter Verwendung eines Plattenreaders

Protease-aktivierte Rezeptoren (PARs)^1,2,3 sind eine Unterfamilie der G-Protein-gekoppelten Rezeptoren (GPCRs) der Klasse A, die in einer Vielzahl von Zelltypen exprimiert werden, einschließlich Blutplättchen und Endothelzellen ^4,5,6,7. Im Gegensatz zu den meisten GPCRs haben PARs einen einzigartigen intramolekularen Aktivierungsmodus. Die meisten GPCRs werden durch lösliche Liganden aktiviert, die mit einer ausgeprägten Bindungstasche interagieren, aber PARs werden durch die proteolytische Spaltung des N-Terminus aktiviert, was zu einem neuen angebundenen Liganden führt, der mit der extrazellulären Schleifen-2-Domäne auf der Oberfläche einer Zelle interagieren kann ^6,8,9. Diese Interaktion aktiviert den Rezeptor und kann mehrere Signalwege initiieren, die Effekte wie Entzündungen und Thrombozytenaktivierung fördern 4,10,11,12. Verschiedene Proteasen können PARs durch Spaltung an einzigartigen Stellen am N-Terminus aktivieren, wodurch unterschiedliche angebundene Liganden (TL) sichtbar werden, die Rezeptorkonformationen stabilisieren, die unterschiedliche Signalwege initiieren ^9,13,14,15. Zum Beispiel wird bei dem am besten untersuchten Mitglied der Unterfamilie, PAR1, die Spaltung durch Thrombin verwendet, um zahlreiche biologische Prozesse zu unterstützen, einschließlich der Thrombozytenaktivierung und der Leukozytenrekrutierung in das Endothel, kann aber zu schädlichen Effekten führen, wenn der Rezeptor überexprimiert oder überaktiviert wird 4,16,17,18,19,20,21 . Umgekehrt kann die Spaltung durch aktiviertes Protein C (aPC) die entzündungshemmende Wirkung und die Aufrechterhaltung der Endothelbarrieren fördern 15,22,23,24,25,26,27,28,29. PARs können auch durch Peptidanaloga der TLs intermolekular aktiviert werden 13,30,31. Diese Peptide werden routinemäßig zur Messung der PAR-Hemmung (Modulation) anstelle von PAR-Targeting-Proteasen verwendet, und sie werden in diesem Protokoll verwendet.

Zahlreiche Erkrankungen sind mit pathologischer PAR1-Signalgebung verbunden, darunter Sepsis^22,32, Herz-Kreislauf-Erkrankungen 33,34,35,36,37,38, Nierenerkrankungen 39,40,41,42, Sichelzellanämie ⁴³, Fibrose⁴⁴, Osteoporose und Osteoarthritis^45,46, Neurodegeneration 47,48,49,50,51 und Krebs 52,53,54,55,56,57,58,59. Antagonisten von PAR1 werden seit den 1990er Jahren als Thrombozytenaggregationshemmer für Herz-Kreislauf-Erkrankungen untersucht, und die wachsende Liste von Krankheiten, die mit dem Rezeptor in Verbindung gebracht werden, erfordert die Identifizierung neuartiger Liganden für den Einsatz als biologische Sonden (Werkzeugverbindungen) oder als potenzielle Therapeutika. Derzeit gibt es nur einen von der FDA zugelassenen PAR1-Antagonisten, Vorapaxar, der zur Behandlung der koronaren Herzkrankheit bei Hochrisikopatienten eingesetzt wird 34,36,37,60. Ein alternativer PAR1-Antagonist, das Pepducin PZ-128, schloss eine erfolgreiche Phase-II-Studie zur Thromboseprävention bei Herzkatheterpatienten ab³⁸. Die Arbeitsgruppe Dockendorff hat sich auf die medizinische Chemie und Pharmakologie einer separaten Klasse von kleinen Molekülen, den PAR1-Liganden, den Parmodulinen^61,62, konzentriert. Im Gegensatz zu berichteten PAR1-Antagonisten wie Vorapaxar sind Parmoduline allosterische, verzerrte Modulatoren von PAR1, die selektiv den_{G-αq-Signalweg} blockieren und gleichzeitig zytoprotektive Effekte ähnlich wie aPC fördern. Im Gegensatz zu potenten orthosterischen PAR1-Antagonisten wie Vorapaxar sind publizierte Parmoduline auch reversibel 63,64,65.

Zunächst wurden Parmoduline von Flaumenhaft und Mitarbeitern hinsichtlich ihrer Fähigkeit identifiziert, die P-Selektin-Expression oder die Granulsekretion in Blutplättchen zu hemmen^61,66. Es war jedoch eine alternative Methode erforderlich, um die Auswirkungen von Parmodulinen auf Endothelzellen zu untersuchen. Eine gängige Methode zur Überwachung der GPCR-bezogenen Signalübertragung ist die Messung der intrazellulären Ca2⁺-Mobilisierung, eines wichtigen sekundären Botenstoffs, der mit einem geeigneten intrazellulären Kalziumbindungsfarbstoff gemessen werden kann^67,68. Es wurden substanzielle Beweise dafür vorgelegt, dass die durch PAR1 induzierte Calciummobilisierung durch die Aktivierung von G_αq ^69,70 erfolgt. Sobald PAR1 durch seinen angebundenen Liganden (oder einen geeigneten exogenen Liganden) aktiviert wird, erfährt es eine Konformationsänderung, die dazu führt, dass Guanosindiphosphat (GDP), das an die G_{αq-Untereinheit} gebunden ist, durch Guanosintriphosphat (GTP) ersetzt ^wird68. Die G_{αq-Untereinheit} aktiviert dann die Phospholipase Cβ (PLC-β), die die Hydrolyse von Phosphatidylinositol 4,5-bisphosphat (PIP2) katalysiert und 1,4,5-Inositoltriphosphat (IP₃) und Diacylglycerin (DAG) bildet. Schließlich bindet IP₃ an IP_{3-empfindliche} Ca2⁺-Kanäle in der Membran des endoplasmatischen Retikulums, wodurch Ca²⁺ in das Zytoplasma freigesetzt werden kann, wo es an^Ca2+-abhängige Fluoreszenzfarbstoffe wie Fluo-4 binden kann, die den Zellen zugesetzt werden⁷¹. Dieser Prozess findet innerhalb von Sekunden statt und kann die Konzentration von Ca2⁺ um das 100-fache erhöhen, was zu einer drastischen Veränderung der Menge an calciumgebundenem Farbstoff und einem robusten Fluoreszenzsignal führt.

Im Jahr 2018 stellte die Dockendorff-Gruppe einen Ca2⁺ -Mobilisierungsassay mit mittlerem Durchsatz vor, der zur Identifizierung von Antagonisten des_{G-αq-Signalwegs} von PAR1⁷² verwendet werden konnte. Der Assay verwendete EA.hy926⁷³, eine hybride humane Endothelzelllinie, die für mehrere Passagen ohne merkliche Veränderung der PAR1-Expression verwendet werden kann und für In-vitro-Messungen zytoprotektiver Wirkungen etabliert ist.

Das ursprüngliche Protokoll verwendete EA.hy926-Zellen in 96-Well-Platten, die mit Fluo-4/AM-Farbstoff beladen waren, der aufgrund seiner intensiven Fluoreszenz bei 488 nm und seiner hohen Zellpermeabilität ausgewählt wurde. Nachdem der Farbstoff in die Zellen geladen war, wurden langwierige Waschschritte mit einem automatisierten 8-Kanal-Liquid-Handler durchgeführt (schnellere Methoden des Liquid Handlings, wie z. B. ein 96-Kanal-Wascher, waren nicht zugänglich). Die Reproduzierbarkeit dieses Assays war besser als die ohne den sorgfältigen, automatisierten robotischen Medienwechsel. Antagonisten wurden dann mit den Zellen inkubiert, PAR1 wurde durch die sequentielle Zugabe eines selektiven Agonisten (jeweils 16 Wells) aktiviert, und Veränderungen der Fluoreszenz infolge der Kalziummobilisierung und Farbstoffbindung wurden gemessen, um die Aktivität zu bestimmen.

Dieses Protokoll ermöglicht zwar die Messung der PAR1-vermittelten Kalziummobilisierung, ist jedoch durch die Zeit begrenzt, die für den Assay jeder 96-Well-Platte erforderlich ist. Lange Experimentierzeiten sind nicht nur deshalb problematisch, weil die Anzahl der Verbindungen, die täglich gescreent werden können, begrenzt ist, sondern auch, weil der Farbstoffausfluss im Laufe der Zeit auftritt und das Assay-Fenster durch Erhöhung der basalen Fluoreszenz verengt. Ein Beitrag zur langen Versuchszeit ist die Verwendung eines 8-Kanal-Liquid-Handlers für die Plattenreinigung, der jedes Experiment um mehr als 30 Minuten verlängert. Die erforderlichen Trinkgelder wurden auch aufgrund von Problemen in der Lieferkette schwierig. Hier wird über ein aktualisiertes Protokoll für den PAR-vermittelten Calciummobilisierungsassay berichtet, der keinen Liquid Handler benötigt und daher mit höherem Durchsatz ausgeführt werden kann. Dieses Protokoll sollte auch für die Messung der Signalübertragung mit anderen GPCRs geeignet sein, die zu einer intrazellulären Kalziummobilisierung führen. Dieses aktualisierte Plattenleseprotokoll ist ideal für akademische und kleine industrielle Labore, die nicht über die Ressourcen für teure Zellbildgebungsinstrumente verfügen, aber zahlreiche Verbindungen schnell screenen müssen. Ein Beispiel für einen Calciummobilisierungsassay mit einem Plate Imager finden Sie unter Caers et ^al.74.