プレートリーダーを用いたカルシウム動員アッセイによるプロテアーゼ活性化受容体のモジュレーターの特性評価(英語)

プロテアーゼ活性化受容体(PAR)^1,2,3は、血小板細胞や内皮細胞^4,5,6,7を含む様々な細胞タイプで発現するクラスA Gタンパク質共役受容体(GPCR)のサブファミリーである。大多数のGPCRとは異なり、PARは独自の分子内活性化モードを持っています。ほとんどのGPCRは、明確な結合ポケットと相互作用する可溶性リガンドによって活性化されますが、PARはN末端のタンパク質分解性切断によって活性化され、その結果、細胞表面の細胞外ループ2ドメインと相互作用できる新しいテザーリガンドが得られます^6,8,9。この相互作用は受容体を活性化し、いくつかのシグナル伝達経路を開始し、炎症や血小板活性化などの効果を促進する^{ことができる}4,10,11,12。異なるプロテアーゼは、N末端のユニークな部位での切断を通じてPARを活性化することができ、受容体の立体配座を安定化させる異なるテザーリガンド(TL)を明らかにし、異なるシグナル伝達経路^{を開始する}9,13,14,15。例えば、サブファミリーの中で最もよく研究されているメンバーであるPAR1では、トロンビンによる切断は、血小板の活性化や内皮への白血球の動員など、多数の生物学的プロセスをサポートするために使用されますが、受容体が過剰発現または過剰に活性化されると有害な影響をもたらす可能性があります4,16,17,18,19,20,21 .逆に、活性化プロテインC(aPC)による切断は、抗炎症作用および内皮バリアの維持を促進することができる15,22,23,24,25,26,27,28,29。PARはまた、TLのペプチド類似体によって分子間的に活性化することもできる13,30,31。これらのペプチドは、PARターゲティングプロテアーゼの代わりにPAR阻害(調節)を測定するために日常的に使用されており、このプロトコルで使用されます。

病理学的PAR1シグナル伝達には、敗血症^22,32、心血管疾患33,34,35,36,37,38、腎臓病39,40,41,42、鎌状赤血球症⁴³、線維症⁴⁴、骨粗鬆症および変形性関節症^{45など、多数の障害が関連しています、46}、神経変性^{47、48、49、50、51}、および癌^{52、53、54、55、56、57、58、59}.PAR1のアンタゴニストは、1990年代から心血管疾患の抗血小板薬として研究されており、この受容体に関連する疾患のリストが増加する中、生物学的プローブ(ツール化合物)または潜在的な治療薬として使用するための新規リガンドの同定が必要とされています。現在、FDAが承認したPAR1拮抗薬は、高リスク患者^34,36,37,60の冠状動脈疾患の治療に使用されるボラパキサールの1つだけです。代替のPAR1拮抗薬であるペプデューシンPZ-128は、心臓カテーテル検査患者の血栓症を予防するための第II相試験を成功裏に完了した³⁸。ドッケンドルフグループは、パルモジュリン^61,62として知られる別のクラスの低分子であるPAR1リガンドの医薬品化学および薬理学に焦点を当ててきました。ボラパクサールなどの報告されたPAR1拮抗薬とは異なり、パルモジュリンはアロステリックで偏ったPAR1のモジュレーターであり、_Gαq経路を選択的にブロックしながら、aPCと同様の細胞保護効果を促進します。ボラパキサールのような強力なオルソステリックPAR1アンタゴニストとは異なり、公表されたパルモジュリンも可逆的である63,64,65。

最初に、パルモジュリンは、血小板^61,66のP-セレクチン発現または顆粒分泌を阻害する能力について、Flaumenhaftおよび同僚によって同定されました。しかし、内皮細胞に対するパルモジュリンの影響を研究するためには、別の方法が必要でした。GPCR関連のシグナル伝達をモニタリングする一般的な方法の1つは、適切な細胞内カルシウム結合色素^67,68を用いて測定できる重要な二次メッセンジャーである細胞内Ca²⁺の動員を測定することである。PAR1によって誘発されるカルシウム動員は、Gαq69,70の活性化によるものであることを示す実質的な証拠が提供されています。そのつながれた配位子(または適切な外因性配位子)によって活性化されると、PAR1は構造変化を起こし、G_αqサブユニットに結合したグアノシン二リン酸(GDP)がグアノシン三リン酸(GTP)に置き換えられます⁶⁸。次に、G_αqサブユニットはホスホリパーゼCβ(PLC-β)を活性化し、ホスファチジルイノシトール4,5ビスホスフェート(PIP2)の加水分解を触媒し、1,4,5-イノシトール三リン酸(IP₃)とジアシルグリセロール(DAG)を形成します。最後に、IP₃は、小胞体の膜におけるIP₃感受性Ca²⁺チャネルに結合し、Ca²⁺が細胞質に放出されることを可能にし、そこで細胞⁷¹に添加されるFluo-4のようなCa²⁺依存性蛍光色素に結合することができる。このプロセスは数秒以内に発生し、Caの濃度を2⁺100倍に増加させ、カルシウム結合色素の量が大幅に変化し、強力な蛍光シグナルが得られます。

2018年、ドッケンドルフのグループは、PAR1⁷²のG_αq経路のアンタゴニストを同定するために使用できるミディアムスループットのCa²⁺動員アッセイを発表しました。このアッセイでは、ハイブリッドヒト内皮細胞株であるEA.hy926⁷³を使用しましたが、これはPAR1発現に顕著な変化なしに複数の継代に使用できるほか、細胞保護効果のin vitro測定に確立されています。

元のプロトコルでは、EA.hy926細胞を96ウェルプレートに充填し、488 nmの強い蛍光と高い細胞透過性のために選択されたFluo-4/AM色素をロードしました。色素が細胞にロードされると、自動化された8チャンネルのリキッドハンドラーで長い洗浄ステップが実行されました(96チャンネルウォッシャーなどのより高速なリキッドハンドリング方法は利用できませんでした)。このアッセイの再現性は、慎重な自動化されたロボット培地の変更がない場合よりも優れていました。次に、アンタゴニストを細胞とインキュベートし、選択的アゴニストを逐次添加してPAR1を活性化し(一度に16ウェル)、カルシウムの動員と色素結合による蛍光の変化を測定して活性を決定しました。

このプロトコルでは、PAR1を介したカルシウム動員の測定が可能ですが、各96ウェルプレートのアッセイに必要な時間には制限があります。実験時間が長いと、1日にスクリーニングできる化合物の数が限られているだけでなく、時間の経過とともに色素の流出が発生し、基礎蛍光が増加することでアッセイウィンドウが狭くなるため、問題があります。実験時間が長い原因の1つは、プレート洗浄に8チャンネルのリキッドハンドラーを使用していることであり、これにより各実験に30分以上かかります。また、サプライチェーンの問題により、必要なチップの入手も困難になりました。ここでは、PAR媒介カルシウム動員アッセイの更新されたプロトコルが報告されており、リキッドハンドラーを必要としないため、より高いスループットで実行できます。このプロトコルは、細胞内カルシウムの動員につながる他のGPCRとのシグナル伝達の測定にも適しているはずです。この更新されたプレートリーダープロトコルは、高価な細胞イメージング装置のためのリソースはないが、多数の化合物を迅速にスクリーニングする必要がある学術および小規模な産業ラボに最適です。プレートイメージャーを使用したカルシウム動員アッセイの例については、Caers et ^al.74を参照してください。